Revisiones Bibliográficas

Recibido para Arbitraje: 29/06/2012
Aceptado para Publicación: 20/07/2012

• Luciano-Muscio, R.; Profesor y Jefe de la Cátedra de Bioquímica de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela. Miembro de la International Association for dental Research. González, A; MSc en Biología Molecular e Ingeniería Genética de la Universidad de Los Andes. Bioanalista. Personal de Investigación del Centro de Investigaciones Odontológicas Facultad de Odontología de la ULA. Gésime
  
  
• Oviedo, J.M., Estudios en bioquímica en el instituto venezolano de investigaciones científicas. Profesor de pre y post grado de la Facultad de Odontología de la Universidad
  Central de Venezuela.

INTRODUCCIÓN

Los Virus del Papiloma Humano (VPH) son los agentes etiológicos más importantes del cáncer cervical ^1,2.

Constituyen un grupo viral heterogéneo cuyo genoma está constituido por ADN de doble cadena helicoidal, con una cápside proteica. Son epiteliotrópicos, infectan el estrato basal del epitelio, manteniendo la transcripción y replicación de su ADN a niveles basales ³, producen lesiones hiperplásicas, papilomatosas y verrugosas en piel y mucosa. Una vez que alcanzan las células basales pueden permanecer en forma episomal, en estado latente, o bien abandonar esa latencia y aprovechar la diferenciación celular propia del epitelio cervical. La relación entre virus papiloma y cáncer es un hecho conocido desde hace mucho tiempo ⁴, su origen viral fue demostrado por primera vez en 1935 cuando Francis Peyton Rous comprobó que el virus del papiloma puede causar cáncer de piel en conejos infectados. Las verrugas caninas podían ser transmitidas a animales saludables usando un extracto ultrafiltrado de las mismas; aclarando posteriormente que en el humano podía transmitirse de manera similar 5. Paralelamente a la maduración del epitelio cervical, los VPH expresan sus genes de forma secuencial; primero los genes tempranos (E1……E8), en las capas basales, luego en capas superficiales del epitelio más diferenciado expresan sus proteínas tardías (L1 y L2) que forman la cápside y permiten el ensamblaje de nuevas partículas virales que repetirán el ciclo. En circunstancias de "permisividad inmunológica" y tras un largo período de persistencia de la infección las partículas víricas que se encuentran en forma episomal, sufren un proceso de integración dentro del genoma celular y con ello desencadenan acontecimientos bioquímicos que conducen al bloqueo de proteínas importantes en el ciclo celular, tales como la proteína p53 (factor regulador de la replicación celular y principal represor de tumores en el ser humano) y la proteína del retinoblastoma (Rb; proteína supresora de tumores); como consecuencia, alteraciones en el crecimiento normal y diferenciación del epitelio cervical seguidas de un acúmulo de errores genéticos (clastogénesis) que son la base de la transformación tumoral ⁶.

Existen más de 230 tipos de VPH (118 de ellos bien caracterizados) ⁷, más de 40 tipos anogenitales, de los cuales 15 son oncogénicos; y en humanos constituyen uno de los grupos virales más frecuentes que infectan el epitelio de piel y mucosas: conjuntivas, cavidad bucal, laringe, árbol traqueobronquial, esófago, vejiga, ano y tracto genital ^5,8.

Nuevas tecnologías diagnósticas: histopatológicas, moleculares, han ayudado a mejorar la detección del virus no solo en la mucosa cervical donde se observa gran porcentaje de afección por VPH sino también en otras áreas anatómicas en las cuales el virus se manifiesta difícilmente ⁹.

Los nuevos tipos de VPH se definen realizando homología de secuencia entre las regiones específicas del genoma, homologías menores a 90% constituyen un nuevo tipo viral, homologías mayores al 90%, un subtipo adicional; cuando varía en 2% en regiones conservadas y hasta en 5% en la región no codificante pero sí reguladora es una variante intratipo ^10,11,12. Estos autores, agrupan los diferentes tipos de VPH de acuerdo a su alto o bajo grado de prevalencia en lesiones intraepiteliales escamosas y en cáncer, resultando VPHs de bajo, intermedio y alto riesgo.

Las lesiones bucales que contienen los VPH, se clasifican en dos grandes grupos: lesiones benignas y lesiones potencialmente malignizables y/o malignas. Las lesiones benignas incluyen: Papiloma Bucal (PB), Verruga Vulgar (VV), Condiloma Acuminado (CA) e Hiperplasia Epitelial Focal (HEF). De éstas entidades, VV, CA y HEF, muestran efectos citopáticos característicos, inducidos por los VPH, por el contrario, tales efectos son poco frecuentes en el PB. Las lesiones potencialmente malignizables y/o malignas incluyen Leucoplasia y el Carcinoma Epidermoide ¹³. Todas estas patologías, muestran una clara asociación con los VPH, la coilocitosis (células con colapso degenerativo del núcleo y espacio prominente alrededor del mismo) es el efecto citopático más común en este grupo, sin embargo, algunas veces es difícil distinguir entre lesiones hiperplásicas tales como PB, VV y CA. Los exámenes clínicos e histológicos pueden facilitar el diagnóstico. Las lesiones bucales benignas están asociadas con los VPH 2, 4, 6, 11, 13 y 32; las lesiones bucales malignas, lo están con los VPH 16, 18, 31, 33 35 ^13,14.

PROPIEDADES GENERALES DE LOS VIRUS DEL PAPILOMA

Los virus del papiloma son pequeños virus de ADN (ácido desoxirribonucleico) de doble cadena. Fueron clasificados como miembros de la familia Papovaviridae que comprende dos géneros, Polyomavirus y Papillomavirus. Entre ellos se encuentran el Polyomavirus del ratón, el virus simio vacuolizante (VS40), dos Polyomavirus Humanos, virus BK y virus JC. Estudios moleculares y genéticos, han demostrado que esta asociación taxonómica es incorrecta cuando se les compara con el VS40 (polyomavirus) debido a que los Papillomavirus presentan un genoma de ADN de mayor tamaño (7.9 kilopares de bases) en comparación con el que presenta el VS40, (Polyomavirus) cuyo genoma de ADN es más pequeño (5.2 kilopares de bases). Esto a su vez conlleva a que el diámetro de la cápside del virión de los Papillomavirus sea también más grande (55 nm) que la de los otros virus mencionados (44 nm). Además los genomas de estos dos grupos de virus, no presentan homología en su secuencia de ADN, no comparten la organización genética de sus marcos de lectura abiertos (MLA) y difieren en los patrones de procesamiento y síntesis de ARN ^15,16.

Según Chang ¹⁷ y de Villiers ¹⁸, los VPH o papilomavirus son un grupo de virus de ADN que pertenecen a la familia Papillomaviridae, no poseen envoltura, con un diámetro aproximado de 52-55 nm. Las partículas virales están compuestas por una cápside proteica, conformada en un 95% por la proteína L1 y en un 5% por la proteína L2, las cuales se ensamblan para formar capsómeros icosaédricos. En el interior de la cápside se encuentra un ADN circular bicatenario de aproximadamente 8000 pares de bases, constituido por ocho genes y una región regulatoria no codificante: La región larga de control (LCR), contiene sitios de unión para factores proteicos y hormonales del hospedador, necesarios para que el virus pueda completar su ciclo de replicación.

Los papilomavirus tienen gran tropismo por las células epiteliales de piel y mucosas. El ácido nucleico viral puede encontrarse en las células precursoras basales, pero la expresión de genes tardíos (proteínas de la cápside), se restringe a la última capa superior de queratinocitos diferenciados. Cabe destacar que ninguno de los virus del papiloma ha sido inoculado in vitro en cultivos de tejidos celulares ¹⁷. Es por ello que estos virus deberán ser considerados como una familia viral diferente.

Clasificación
A diferencia de lo que ocurre en otras familias virales, las proteínas de la cápside de los diversos tipos de VPH son antigénicamente similares, por lo tanto los VPH no pueden ser clasificados en serotipos; de tal forma, que su clasificación en genotipos y subtipos se basa en el porcentaje de homología de su secuencia de ADN. Los nuevos tipos de VPH se definen realizando homología de secuencia entre regiones específicas del genoma (genes E6, E7 y L1) los cuales muestran segmentos altamente conservados (homologías menores a 90% constituyen un nuevo tipo viral, homologías mayores a 90% constituyen un subtipo adicional y cuando varía en 2% en regiones conservadas y hasta en un 5% en la región no codificante, (upstream regulatory región, URR) una variante intratipo ^10,12.

Han sido caracterizados 230 tipos diferentes de VPH 7, los cuales pueden clasificarse en dos grupos principales: cutáneos y mucosos. Los tipos de VPH mucosos asociados con lesiones benignas (VPH 6 y 11 principalmente, y 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 entre otros) son conocidos como de "bajo riesgo", mientras que aquellos asociados a lesiones malignas (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 68, 73, 82) son conocidos como virus de "alto riesgo" ^19,22.

Estructura del Virión
Los virus del papiloma aislados en diferentes hospederos tienen una apariencia muy similar, presentan un genoma de ADN encerrado dentro de una cápside de proteínas virales. La cápside está compuesta de 72 subunidades o capsómeros, los cuales tienen una simetría icosaédrica dándole al virión una apariencia esférica al ser observado al Microscopio Electrónico de barrido ^23,24.

El análisis bioquímico de la cápside ha mostrado dos tipos diferentes de proteínas estructurales: una proteína mayor de PM 54.000 Daltons y una proteína de menor PM 76.000 Daltons ²⁵. La proteína mayor de la cápside produce reactividad cruzada, y sirve como antígeno específico del género. La proteína menor de la cápside parece ser de tipo específico y brinda un provechoso blanco para el tipaje inmunohistoquímico de la infección por virus papiloma humano ²⁵.

Organización y Regulación del ADN viral
Todos los virus papiloma tienen un genoma de ADN de doble cadena circular con una longitud de nucleótidos alrededor de 7,9 kilopares de bases con un PM de 5,2x10⁶ Daltons ^24,26,27. El ADN viral está combinado con histonas (derivadas de la célula del hospedero) adoptando una condensación nucleosomal, típica de células eucarióticas ²⁸.

Toda la información genética viral está localizada en una de las cadenas del ADN del genoma. El genoma del VPH está dividido funcionalmente en dos dominios, cada uno contiene una serie de marcos de lectura abiertos (MLA) que codifican diferentes proteínas ^29,30. La región temprana (E) comprende aquellos genes transcritos inicialmente representando el 45% del genoma viral. Contiene ocho MLA que codifican para las proteínas asociadas con la regulación de la transcripción viral y la replicación del genoma (E1, E2, E4, E5, E6 y E7). La región de genes transcritos tardíamente (L), comprende un 40% del genoma, contiene dos largos MLA que codifican para las proteínas estructurales de la cápside del virus (L1 y L2) ³¹. La región regulatoria está comprendida entre el final de la región perteneciente al MLA L1 y el comienzo de la región MLA E6 y contiene el origen para la replicación del ADN, varios promotores para la síntesis del ARNm, que elongan secuencias transcripcionales ^31,32,33, representa el 15% del genoma viral el cual no tiene capacidad codificante, pero, contiene los elementos regulatorios virales.

En lesiones benignas, el ADN viral se encuentra como una cadena circular cerrada que no integra el material cromosómico del hospedero, en tanto que, en tumores malignos, el ADN viral se encuentra integrando el material cromosómico del hospedero, usualmente en los sitios de los MLA E1, E2 ³⁴. En los VPH de bajo riesgo no se unen las proteínas E6 y E7 a p53 y Rb y si hay unión, la afinidad es muy baja ³⁵.

VIRUS PAPILOMA Y LA INTERACCIÓN VIRUS HOSPEDERO

Las funciones productivas de los virus papiloma (VP) incluyendo la síntesis del ADN y la expresión de los genes virales tardíos para codificar las proteínas de la cápside están estrechamente acopladas a la diferenciación de las células epiteliales. Solamente las células diferenciadas del estrato espinoso y del estrato granuloso permiten la replicación productiva del VP ³⁶.

Taichman y cols. ¹⁵ destacan que las partículas virales maduras están ausentes de las células de la capa basal. Esto indica que los estadios del ciclo viral requieren factores específicos que solo pueden ser provistos por los programas de diferenciación secuencial de los queratinocitos permisivos. Por lo tanto, las infecciones por VP tienen tropismo por el epitelio escamoso.

Howley y Schlegel ³⁶ evidenciaron el papel de los VP en el desarrollo de tumores malignos. La mayor dificultad para esclarecer el papel de los VP en oncogénesis ha sido la falta de un apropiado sistema de cultivo in vitro, el cual podría permitir la replicación de los virus y la transformación de las propiedades a ser analizadas.

Fey y Moselarsen ³⁷ señalan que las interacciones entre virus y células pueden estar divididas principalmente en tres grupos: infección permisiva, infección no permisiva transformable e infección no permisiva no transformable, dependiendo del virus en particular y la célula involucrada. La infección permisiva resulta en la síntesis de ADN viral episomal, ARN, proteínas, que intervienen en el ensamblaje y liberación de la partícula viral ³⁸. En la interacción no permisiva no transformable las células que se describen como no permisivas, nunca pueden ser transformadas por un virus en particular. La infección no permisiva transformable ocurre como un evento raro y a menudo observamos el resultado de la integración del virus ADN en el genoma del hospedero ³⁷.

Las células basales son el blanco para la infección de los VP. Los virus pueden alcanzarlas cuando están expuestas por una herida o abrasión; se requiere un medio ambiente apropiado para su maduración. Las células basales son células no permisivas para la maduración de los VP. Durante el tránsito de la capa basal a la superficie de los queratinocitos, sufren cambios complejos. Estos cambios provienen de un apropiado micro ambiente intracelular para producir replicación viral (células permisivas) ^16,38.

Diversos estudios han demostrado que: Ciertos tipos de VPH (particularmente 16 y 18) están asociados con tumores malignos ^1,39,40. El estado físico del ADN de los VP en lesiones precancerosas (episomal) y cancerosas (integración) son diferentes ^41,42. En tejidos infectados productivamente (una verruga) el ARNm (mensajero) es transcrito en ambas regiones E y L, mientras que solo la región E es transcrita en infección no productiva de células hospederas ⁴³. Las regiones E6 E7 (MLA) son especialmente transcritas en carcinoma cervical y líneas celulares derivadas ^44,45. Las mismas regiones son requeridas in vitro para la transformación de las células de roedores y para la inmortalización de los queratinocitos humanos ^46,47.

Zur Hausen ^48,1 propone que el desarrollo de malignidad requiere un mínimo de tres pasos: persistencia del ADN viral; inactivación de la primera copia en la especie del gen que codifica los factores de interferencia celular en el hospedero; inactivación de compartimientos alélicos.

ASOCIACIÓN DE LA INFECCIÓN POR VPH CON EL CÁNCER BUCAL

Aunque el cáncer de cabeza y cuello está relacionado con el uso del tabaco y el alcohol, hay una incidencia cada vez mayor relacionada con VPH 16 en la orofaringe; se ha observado integración viral de los transcritos E6/E7 de los VPH de alto riesgo los cuales causan desregulación del ciclo celular mediante la inactivación de p53 y pRb, respectivamente ⁴⁹. Los carcinomas de cabeza y cuello que contienen ADN de VPH 16 activos transcripcionalmente se caracterizan por la deleción ocasional de los cromosomas, al contrario de los cánceres que carecen de este ADN viral, los cuales se caracterizan por la pérdida casi total de grandes regiones cromosómicas, eventos iniciales oncogénicos; estos distintos patrones de alteraciones genéticas sugieren que la infección por VPH 16 es un evento temprano en el desarrollo del cáncer de cabeza y cuello ⁵⁰.

La posibilidad de la infección por VPH en la etiología del cáncer bucal fue señalada por Syrjänen y cols. ⁵¹, quienes comprobaron que de 40 muestras de carcinoma bucal, 16 de estas (40%), mostraron lesiones que sugieren la presencia de VPH. Cuando las 16 muestras fueron teñidas por inmunohistoquímica, 8 de ellas, mostraron reactividad positiva para VPH. La tinción positiva estuvo localizada en el epitelio adyacente al carcinoma invasivo. La misma serie de biopsias, fueron analizadas para detectar la presencia del ADN de los VPH por medio de hibridación in situ y RCP (Reacción en cadena de la polimerasa) revelando que de las 40 muestras, 12 (30%) tenían VPH 11, 16 y 18. Syrjänen y cols. ⁵² encontraron que de 51 carcinomas de cavidad bucal estudiados, en 6 de estos (11,7%), se identificó la presencia de ADN de los VPH 6, 11, 16 y 18; de Villiers ⁵³, determinó la presencia de distintos tipos de VPH en 7 casos de carcinoma de lengua y demostró que en uno de ellos se pudo identificar al VPH 2 y en otros dos al VPH 16. Por consiguiente, el VPH 16 pareciera ser el tipo más frecuente de virus asociado con el carcinoma bucal. Chang 17 encontró ADN del VPH 16 en 13 (76.4%) de 17 carcinomas de células escamosas bucales estudiadas. Este virus fue también encontrado en la papulosis bowenoide bucal ⁵⁴.

El Carcinoma Verrugoso de la cavidad bucal es una variante del carcinoma de células escamosas bien diferenciado ⁵⁵, su desarrollo ha sido relacionado con el consumo de grandes cantidades de tabaco en conjunto con la nuez de betel. Las características histológicas que muestran papilomatosis, disqueratosis y coilocitosis sugieren una etiología por VPH. Existen evidencias que indican que los VPH ejercen un efecto oncogénico sobre la célula, interactuando con ciertas proteínas celulares. Los genes E6 y E7 inducen a que el VPH 16 sea un potente agente de transformación in vitro ⁵⁶; las proteínas del gen E7 del VPH 16 se unen al producto del gen del retinoblalstoma (Rb) ⁵⁷ y la proteína del gen E6 del VPH 16 se une al producto del gen p53 ⁵⁸.

Chaudhary cols. ⁵¹, Campisi y Giovannelli ⁵⁹ y Chen y cols. ²⁷, sugieren que las variantes combinadas de p53 y p73 aumentan significativamente el riesgo de cáncer bucal asociado a VPH 16, especialmente entre los no fumadores; además se ha encontrado que la infección por VPH en este tipo de cáncer, es un factor de pronóstico positivo en pacientes que no consumen alcohol ni tabaco, con una reducción del 60-80% en el riesgo de muerte debido a una mayor sensibilidad hacia la radioterapia.

LESIONES BUCALES EN HOSPEDEROS INMUNOSUPRIMIDOS

Pacientes inmunosuprimidos con verrugas en piel y genitales presentaron una lesión bucal poco común asociada con la presencia de los VPH. Lutzner y cols. ²⁹ fueron los primeros en describirla en un paciente inmunosuprimido con transplante renal con múltiples verrugas en piel, papiloma recurrente anal y genital y múltiples condilomas acuminados en la mucosa gingival. El VPH 16 ha sido detectado en pápulas y placas así como en carcinoma invasivo de la lengua en pacientes masculinos inmunosuprimidos ³⁰ y en hiperplasia gingival en pacientes femeninos inmunosuprimidos ³¹.

Varios estudios han reportado lesiones bucales asociadas con los VPH de aspecto clínico poco usual en pacientes que presentan positividad al Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) ³². Se reportaron 2 lesiones bucales en un paciente masculino VIH positivo, clínicamente diferentes a las lesiones bucales asociadas con VPH y muestran extensos cambios coilocíticos. El hallazgo del VPH 7 en una de estas lesiones, ha sido de gran interés, pues casi siempre éste se encuentra en verrugas presentes en piel, comúnmente asociadas con lesiones bucales en pacientes VIH positivos ³³.

La leucoplasia pilosa bucal es una lesión blanca, de superficie corrugada y pilosa que se localiza sobre el borde lateral de la lengua en pacientes inmunosuprimidos, originalmente asociadas con los VPH ³⁴. Sin embargo, esta asociación no ha sido confirmada por estudios de Greenspan K y cols. y Greenspan D y cols. ^33,32. Ahora, se cree que la leucoplasia pilosa bucal está asociada con el virus Epstein Barr ^34,32.


MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LOS VPH

Características Clínicas
Kellokoski y cols. ⁶⁰ destacan que los VPH están generalmente circunscritos a sitios específicos del cuerpo, por lo que el examen clínico tomando en cuenta la localización y características clínicas de la lesión constituye la primera evidencia de una infección por este virus. El condiloma acuminado y el papiloma de la cavidad bucal son morfológicamente idénticos a los del tracto genital y a los de la laringe. Presentan un color blanco o rosado, forma de coliflor, bordes pronunciados y superficie irregular. Existen infecciones por VPH en forma latente y subclínica, lesiones por VPH planas que no son clínicamente identificadas.

Características Histológicas
Los patólogos observan principalmente: Cambios coilocíticos: células que muestran colapso degenerativo del núcleo y espacio prominente alrededor del mismo; Disqueratosis: queratinización anormal de las células, proceso complejo en el que está involucrada la diferenciación de células epiteliales; Hiperplasia de las células basales: Incremento anormal en el número de células; Acantosis: engrosamiento de la capa de células espinosa.

La presencia de todos estos cambios coincide con un diagnóstico compatible con una infección por VPH sin presentarse prácticamente ninguna duda, surgen problemas cuando todos estos cambios no están presentes o algunos de ellos se presentan en grado extremo. Este tipo de metodología depende del patólogo y el diagnóstico puede variar cuando las muestras de tejido son algo atípicas. Asimismo, esta técnica tiene la limitante de no proveer ninguna información sobre el genotipo del virus infectante. Más aun, este tipo de examen no permite detectar en algunas ocasiones infección por VPH porque las células aparecen como normales ^61,62,63.

Microscopia de Luz
El cambio morfológico patognomónico de infección por VPH son las células coilocíticas. Ellas se encuentran en la capa superior e intermedia del epitelio mostrando un colapso degenerativo del núcleo y un espacio prominente alrededor del mismo (vacuolización citoplasmática). Alrededor de este halo, el citoplasma está condensado. La distinción entre células coilocíticas verdaderas y otras células vacuolizadas ha sido recientemente discutida ⁶⁴. Tal distinción es importante en la cavidad bucal, en donde hay diferentes tipos de células vacuolizadas que no tienen relación con los VPH. Otros cambios citológicos importantes lo constituyen las células que muestran una queratinización anormal (disqueratosis), tanto aisladas como agrupadas. Las células coilocíticas y disqueratóticas muestran dos o más núcleos, se observa papilomatosis, acantosis, hiperplasia basal, elongación o ensanchamiento de los mamelones epiteliales.

Microscopia Electrónica
Ferenczy y cols. ⁶⁵, refieren que la sensibilidad del microscopio electrónico para la detección de infección por VPH en genitales está entre el 10% y 50%. Las partículas de los VPH en lesiones epiteliales de la cavidad bucal se encuentran en el núcleo de las células coilocíticas y disqueratóticas.

Inmunohistoquímica
Para reconocer los virus en frotis celulares o cortes de tejidos se usan antisueros comerciales preparados mediante la inmunización de animales con virus purificados. Estos reaccionan fundamentalmente con los antígenos específicos de grupos de la cápside, los cuales son altamente reactivos. Sin embargo, la producción de partículas virales en tejidos infectados es limitada por lo que el número de células productoras de antígenos susceptibles de ser detectadas es muy pequeño. Además, los reactivos serológicos específicos de grupo no permiten distinguir los diferentes tipos de VPH. Por último, en lesiones con infecciones no permisivas donde las proteínas estructurales virales no son expresadas (o poco expresadas) pero el ADN viral persiste, pueden dar falsos negativos ⁶⁶.

Hibridación del ADN
Con las técnicas de biología molecular es posible determinar la presencia del ADN viral, hibridando el ADN celular con sondas moleculares específicas para un determinado tipo de VPH ⁶⁷. Las cadenas de ADN del virus se separan y se mezclan con ADN vírico desnaturalizado, previamente clonado y marcado (sonda). Si el ADN celular contiene secuencias nucleotídicas virales, se producirá una interacción (hibridación) de pares de bases con las cadenas complementarias de la sonda de ADN. La detección puede hacerse de una manera directa mediante un revelado autoradiográfico o colorimétrico. Se usan varios métodos como: la transferencia Southern blot, la hibridación inversa y la hibridación en sandwich. Otros tests pueden ser realizados directamente sobre tejidos o en citologías, por ejemplo: la hibridación in situ (HIS) y la hibridación in situ en filtros (HISF) ⁶⁸.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP)
La RCP es una técnica que consiste en amplificar una secuencia blanco, mediante su síntesis repetida a través del uso de cebadores o primers que delimiten esta secuencia, una polimerasa termoresistente, desoxirribonucleótidos, y cambios cíclicos de temperatura; primero se desnaturaliza el ADN de la muestra mediante calentamiento, luego, se enfría la mezcla de reacción para permitir el reconocimiento o acoplamiento de los primers los cuales están en exceso, seguidamente, la polimerasa elonga los primers usando como molde la secuencia blanco (si ésta está presente). Estos pasos se repiten tantas veces como se desee aumentando así (según transcurren los sucesivos ciclos) el número de copias de la secuencia blanco. La acumulación del producto amplificado es tal, que puede ser visualizado luego de una electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio para su detección con iluminación ultravioleta ^69,66. Esta técnica ha sido aplicada para la detección de VPH en lesiones de la cavidad bucal usando muestras en fresco, fijadas en formalina o biopsias en parafina ¹⁷. La gran limitante de esta técnica es el no poder detectar si el virus está dentro de la célula o fuera de ella ⁶⁶.


LESIONES POTENCIALMENTE MALIGNIZABLES Y/O MALIGNAS CAUSADAS POR VPH EN LA CAVIDAD BUCAL

Leucoplasia Bucal
La leucoplasia bucal (LB) es definida clínicamente como una placa o parche blanco que no puede ser eliminada al frotarse ⁷⁰. Histológicamente se observa una variedad de cambios epiteliales que van desde una inofensiva hiperplasia epitelial con hiperqueratosis e hiperortoqueratosis hasta varios grados de displasia epitelial, incluyendo el carcinoma in situ ⁷¹. Debido a la alta frecuencia de carcinomas bucales que se desarrollan en zonas donde hay LB, esta entidad ha sido tradicionalmene considerada como una lesión potencialmente malignizable ⁷⁰.

Ha recibido mucha atención el papel de los VPH en leucoplasia bucal, más aun, cuando efectos citopáticos virales fueron descritos en estas lesiones hace una década ⁷². Esta iniciativa fue soportada por los hallazgos de coilocitosis en la capa de células espinosa de queratocitos no específicos que albergan los VPH tipos: 6, 11, 16 y 18 ⁷³. Estos VPH han sido detectados en leucoplasias potencialmente malignizables ^74,75, así como también, en lesiones leucoplásicas que mostraron diferentes grados de displasia ^76,68. Los tipos de VPH encontrados, son similares a los presentes en lesiones potencialmente malignizables de la mucosa genital ^75,71; los VPH tipos 2 y 6 juegan un papel primordial en la iniciación de estas lesiones.

Leucoplasia Pilosa Bucal
La leucoplasia pilosa bucal (LPB) es una entidad que fue descrita por primera vez por Greenspan y cols. en 1984 ⁷⁶, se caracteriza por parches blancos con una superficie corrugada y pilosa, comúnmente localizada sobre el borde lateral de la lengua. Las características histopatológicas incluyen hiperqueratosis y acantosis con alteraciones vacuolares en las células epiteliales. Estas lesiones afectan grupos poblacionales con inmunosupresión tales como los pacientes hemofílicos, la mujer VIH positivo, la leucemia mieloblástica y los drogadictos ⁷⁶.

Los antígenos del VPH y las partículas del virus Herpes fueron demostrados dentro del núcleo de las células epiteliales por. Greenspan y cols. ⁷⁶. Posteriormente Greenspan y cols. ⁷⁷ confirmaron la presencia de los antígenos VPH y demostraron que las partículas que parecían virus Herpes eran realmente el virus Epstein-Barr (VEB). Ambos, el VPH y el VEB, fueron encontrados en las mismas células. Estudios posteriores realizados Greenspan JS, Greenspan D y Lennette ET ⁷⁷, reportaron también la presencia del VEB (partículas virales y el ADN viral) en estas lesiones, pero, no han podido confirmar la coexistencia del VPH.

Liquen Plano Bucal
El Liquen Plano (LP) es una enfermedad relativamente común de etiología desconocida que puede comprometer la piel y las membranas de la mucosa bucal. Las lesiones bucales pueden encontrarse en cualquier superficie de la mucosa, pero la mucosa bucal está casi siempre afectada y la lengua comúnmente comprometida ⁷⁸. El LP bucal histológicamente se caracteriza por hiperqueratosis, ruptura de la capa basal, engrosamiento de la lámina basal y su reemplazo por una banda eosinofílica. Un denso infiltrado linfocítico o linfohistiocítico está presente inmediatamente subyacente al epitelio. Evaluaciones morfológicas e histoquímicas de los linfocitos residentes en el LP bucal han revelado que la población de linfocitos predominante es de células T ^79,78. El LP ha estado asociado con un número de enfermedades generalizadas como diabetes, hipertensión y con alteraciones inmunológicas.

La posible etiología viral es también propuesta por recientes estudios con VPH en un alto porcentaje de las lesiones bucales. Kashima y cols. ⁸⁰, demostraron mediante el empleo de la inmunoperoxidasa y por la hibridación del ADN la reacción positiva entre un grupo de lesiones de Liquen Plano con los antígenos de VPH. Por otra parte, Maitland y cols. ⁷⁵ reportaron que el 87% de las biopsias realizadas a lesiones de LP contenían ADN del VPH. Hasta los momentos, el VPH 11 y VPH 16 se han encontrado asociados a estas lesiones.

Carcinoma Epidermoide
El carcinoma epidermoide es la neoplasia maligna más común de la cavidad bucal. Se ha descrito con mayor frecuencia en zonas como: lengua, piso de la boca, mucosa alveolar, paladar, mucosa vestibular ⁸⁰. Los factores etiológicos ambientales a los que se atribuye la formación del cáncer bucal son: tabaco, alcohol, sífilis, deficiencias nutricionales, luz solar, calor proveniente de diversas fuentes tales como, la boquilla de la pipa, fumar con la candela hacia adentro, combustión del tabaco, traumatismos e irritación ⁸¹. Histológicamente hay neoplasias que presentan diferentes grados de diferenciación en el tejido queratinizado.

El carcinoma epidermoide bien diferenciado se compone de capas y nidos de células que se originan de epitelio escamoso. Las células suelen ser grandes y presentan una membrana celular definida; las características más sobresalientes son: la presencia de queratinización celular individual y la formación de perlas epiteliales o de queratina de diversos tamaños. Los carcinomas epidermoides moderadamente diferenciados, pierden ciertas características, de manera que, su semejanza con el epitelio escamoso es menos pronunciada. Los carcinomas poco diferenciados conservan poca semejanza con sus células originales y suelen presentar dificultades diagnósticas debido al aspecto primitivo e inespecífico de las células malignas de división rápida.

El papel de los VPH en la patogénesis del carcinoma de células escamosas bucal es desconocido. La presencia de antígenos capsulados de los VPH demuestran estar directamente relacionados con los grados de diferenciación escamosa. En estudios realizados a 250 casos de carcinoma bucal se ha encontrado que el 25% aloja secuencias de ADN de los VPH ^68,75,82. Este porcentaje es considerablemente más bajo que el reportado por la presencia de VPH en cáncer genital 83. Como en el caso de cáncer genital, los VPH 16 y 18 son los tipos de virus más comunes en el carcinoma bucal, están presentes en un 80% de las lesiones. Además, los VPH 2, 6 y 11 han sido hallados en carcinoma de células escamosas ⁸³.


LESIONES BENIGNAS CAUSADAS POR VPH EN LA CAVIDAD BUCAL

Papiloma Bucal
El Papiloma Bucal (PB) es una lesión benigna común de la mucosa bucal; puede ocurrir a cualquier edad, pero es más frecuente en pacientes que están en la tercera y quinta década 84. Afecta el paladar blando, dorso, borde lateral de la lengua y labio inferior, tiene un tamaño mayor de 1 centímetro. El PB es una lesión usualmente solitaria, exofítica, de base pedunculada, con apariencia rugosa papilomatosa 85. Las características histológicas en el PB consisten en proyecciones delgadas en formas de dedos con una porción central fibrovascular cubierta por hiperqueratosis y un epitelio escamoso acantótico. El hecho que las células coilocíticas no son relativamente comunes lo distingue de las verrugas cutáneas ⁸⁵.

En principio, no se conocía la presencia de los VPH en el PB, pero, posteriormente, fue demostrada la presencia de partículas virales principalmente de los VPH 6 y 11, estos hallazgos sugieren el papel causal de los VPH en el desarrollo de esta lesión ^86,66. Los VPH 6, 11, 13, 16 y 32 han sido detectados en papilomas, siendo los tipos 6 y 11 los más comunes en estas lesiones ^87,72,64 los cuales están asociados con un comportamiento biológico benigno ⁸⁷.

Condiloma Acuminado Bucal
El Condiloma Acuminado Bucal (CAB) es una lesión rara reportada como resultado de relaciones sexuales orogenitales o mediante la transmisión mano a boca por autoinoculación ^88,89. Las lesiones bucales pueden ocurrir sin acompañamiento de lesiones anales y genitales ^90,91. Clínicamente el CAB presenta múltiples nódulos pequeños blancos o rosados, los cuales proliferan y colapsan para formar una lesión blanda, sésil y nodular, dando una superficie parecida a un coliflor más que en el papiloma. Por el contrario el papiloma bucal tiene una superficie papilomatosa y su base es pedunculada ⁹². Histológicamente las lesiones se caracterizan por la presencia de un epitelio escamoso estratificado, presentando una marcada acantosis, escasa paraqueratosis con mamelones epiteliales gruesos y elongados. Las células coilocíticas son comunes en la capa superior (córnea) e intermedia (espinosa) del epitelio ⁹².

Evidencias del papel etiológico del VPH en el CAB han sido comprobadas a través del microscopio electrónico al visualizarse las partículas virales 10, demostrándose la presencia de antígenos VPH ⁶⁶. Estudios de hibridación de ADN han detectado la presencia de los VPH tipo: 2, 6, 11, 16 y 32 en el condiloma acuminado de la cavidad bucal, estando presentes los VPH tipo 6 y 11 en más del 85% de estas lesiones ^93,94,95.

Verruga Vulgar Bucal
La Verruga Vulgar (VV) se considera una de las lesiones más frecuentes de la piel, generalmente inducidas por los VPH 1, 2 y 4, aparecen en niños en edad escolar, jóvenes y adultos, se ubican frecuentemente en manos y dedos; se ha observado que pacientes con VV pueden desarrollar Verruga Vulgar Bucal (VVB) por autoinoculación sobre el borde bermellón o en la mucosa bucal, aparece en forma solitaria o múltiple. 96,97. Esta lesión puede presentarse con alguna variedad clínica, pero por lo general, se caracteriza por ser sésil, circunscrita, de crecimiento lento, exofítico, de superficie rugosa y coloración blanquecina, poseen un tamaño que no pasa de 1 centímetro de diámetro y sobresalen aproximadamente 3 a 4 milímetros ⁹⁸.

Histopatológicamente se caracteriza por una superficie papilomatosa con hiperqueratinización y acantosis. La capa granulosa es frecuentemente prominente entre las elevaciones papilomatosas, las cuales se forman alrededor de la papila de tejido conectivo. Los mamelones epiteliales centrales son alargados y los laterales en la base de la lesión son convergentes ⁴. Se observa la presencia de células coilocíticas, situadas en la capa superior de la capa espinosa y en la capa granulosa ⁹⁹. Como en la VV de la piel, la VVB está relacionada con los VPH. Los tipos de VPH relacionados con la mucosa (VPH 6, 11, 16) y los tipos de VPH cutáneos (VPH 1, 2, 4 y 7) han sido reportados en las lesiones de VVB. En los últimos años, el VPH 2 y 4 (frecuentemente asociados a la VV cutánea) han sido detectados en más del 55% de las lesiones bucales ¹⁰⁰.

Hiperplasia Epitelial Focal
La Hiperplasia Epitelial Focal (HEF), (enfermedad de Heck), es una lesión que se observa raramente en algunos individuos 101. La hiperplasia epitelial benigna aparece clínicamente con múltiples o solitarias elevaciones nodulares, comúnmente afecta mucosa bucal, lengua, labios (especialmente el inferior), extendiéndose al borde bermellón ^101,102. Existe una predisposición genética, prevalece en ciertas áreas geográficas y entre ciertos grupos raciales, apareciendo frecuentemente entre indios americanos 101 y esquimales de Groenlandia. Soneira y Fonseca reportaron y describieron por primera vez en 1964, tanto clínica como histopatológicamente, una lesión papilomatosa multifocal con sus variaciones clínicas, desde una pápula a múltiples lesiones papilomatosas en la mucosa yugal, labios, entre otras regiones de la mucosa bucal. Fue observada en 160 niños indígenas venezolanos de la Misión de los Ángeles del Tokuko, Estado Zulia. Los autores observaron la enfermedad en 54 de estos niños (33,75%). Ellos sugirieron que la enfermedad tenía una etiología viral ¹⁰³. Una predisposición hereditaria para la HEF ha sido sustentada por casos de ocurrencia familiar ^{104,105,106,107} observando las mismas lesiones y albergando tipos similares de VPH. Las lesiones tienden a ocurrir en niños menores de 18 años, aunque con el incremento del número de lesiones ha sido descrita también en adultos.

Histológicamente se caracteriza por hiperplasia epitelial con moderada hiperparaqueratosis, acantosis, elongación y anastomosis de los mamelones epiteliales ¹⁰⁸, los cambios citológicos incluyen células epiteliales mostrando degeneración nuclear, células vacuoladas con núcleo picnótico y células mostrando degeneración en forma de globo. La coilocitosis, la cual es comúnmente relacionada como el efecto citopático del VPH, está constantemente presente en estas lesiones. Las partículas virales y los antígenos de VPH han sido reportados en pacientes con HEF, sugiriendo una etiología viral ¹⁰⁸.

Con las técnicas de hibridación con ADN, el VPH 1 fue el primer tipo de virus identificado 108. Otros tipos de VPH encontrados en HEF incluyen: VPH 6 ¹⁰⁸, VPH 11 ⁶⁴, VPH 13 ^64,105, y VPH 32 64. En más del 90% de los individuos que presentan HEF se ha podido identificar el ADN de los VPH 13 y 32 ^{105,110,108,112}. Es bueno hacer notar, que estos dos tipos de VPH han sido raramente detectados en otras lesiones bucales, pero nunca fuera de la cavidad bucal, demostrando que estos dos tipos de VPH son patognomónicos de la HEF ¹¹³.


CONCLUSIONES

• El VP juega un papel importante en el desarrollo del carcinoma de células escamosas en los tractos anal, genital, bucal, epidermodisplasia verruciforme y en laringe.
  
  
• La mucosa bucal expuesta a microtraumas, microorganismos, factores químicos y físicos, pueden actuar sinérgicamente con los VPH para ocasionar el desarrollo de los carcinomas.
  
  
• El establecimiento de modelos de oncogénesis mediados por VPH en el cuello uterino son fácilmente extrapolables a la cavidad bucal.
  
  
• La ubicación de los VPH en otros tejidos nos sugiere que necesitamos estudiar la prevalencia de la infección por los VPH en una serie de especímenes en mucosa bucal, esto nos ayudará a determinar si los VPH son pasajeros o si están específicamente involucrados en el desarrollo de las lesiones bucales cuya asociación no está todavía muy clara aunque, las lesiones bucales benignas contienen VPH tipo: 2, 4, 6, 11, 13 y 32.
  
  
• En las lesiones bucales malignas comúnmente se encuentran VPH tipo:16, 18, 31, 32, 33 y 35.
  
  
• Estudios posteriores deberán observar el progreso de lesiones displásicas necesarias para explorar el potencial oncogénico de los VPH en lesiones que muestran cambios premalignos.