Trabajos Originales

Sensibility in vitro of streptococcus mutans to sanguinarina, fenolic compound and clorherxidina

• MARÍA VALENTINA CAMEJO SUÁRES, Profesora Asistente de la Cátedra de Odontología Operatoria , Postgrado en Endodoncia, Facultad de Odontología . U.C.V. Miembro de la Sociedad Venezolana de Endodoncia.

INTRODUCCIÓN:
La caries dental es una enfermedad conocida desde la antigüedad, la cual afecta a gran parte de la población.

Investigaciones han determinado que es una enfermedad infecciosa y transmisible, cuyo signo más obvio es la presencia de la destrucción localizada de los tejidos duros del diente, producto de la acción de los ácidos provenientes del metabolismo de los carbohidratos por parte de las bacterias de la placa dental.

En la actualidad hay una necesidad de controlar las causas primarias de la caries antes del tratamiento restaurador correctivo. En las últimas dos décadas, gran número de investigaciones han dado a conocer la existencia de una distinción nítida entre caries dental-una enfermedad infecciosa- y su resultado- las cavidades- , determinando bien claro que la enfermedad se establece en boca, algunos años antes que la aparición de sus señales clínicas. Esto indica que es posible diagnosticar e interferir en el proceso de caries, antes que las cavidades aparezcan, como se hace en cualquier enfermedad infecciosa (Weyne,1991).

Se ha considerado que el papel de la placa dental en el inicio del proceso carioso, es fundamental, aunque no todos los tipos de placas están asociados a la caries, ésta no se desarrolla en ausencia de la misma.

Estudios sobre la relación entre la caries y la composición microbiana de la placa dental han indicado una positiva correlación entre la caries y la frecuencia en la placa de Streptococcus mutans y microorganismos productores de polisacáridos intracelulares ( Mikkelsen y Poulsen,1976).

En la actualidad existen evidencias de que los estreptococos del grupo mutans desempeñan un papel preponderante en la etiología de la caries en humanos. Son muy acidogénicos y acidúricos y su potencial cariogénico es bien conocido en animales. Colonizan preferentemente los dientes, siendo encontrados en grandes proporciones en los surcos y fisuras, áreas de contacto y otras zonas retentivas, de manera que su patrón de colonización se relaciona con la mayor susceptibilidad de algunas áreas a la caries dental ( Weyne,1991).

Zickert en1982, refiere la reducción de S. mutans en las superficies dentarias al colocar directamente medios antibacterianos, la cual es seguida por una reducción en la actividad de caries.

Emilson y Krasse en 1985, establecen que el control de la infección cariogénica y consecuentemente, el control de la caries pueden ser hechos a través de: la interrupción de la transmisión del agente infeccioso, de su eliminación o reducción y de la protección de las personas susceptibles, con la implementación de el control dietético y el uso de sustancias antimicrobianas (Weyne, 1991).

Grossman et al. en 1989, realizaron un estudio comparativo entre enjuagues bucales antibacterianos: clorhexidina, compuesto fenólico y sanguinarina, y determinaron su efectividad en cuanto a reducción de placa, demostrando que entre ellos la clorhexidina provee gran reducción de placa.

Se puede pensar que S. mutans es sensible a la acción de los enjuagues bucales: sanguinarina (Veadent), compuesto fenólico (Listerine) y clorhexidina (Peridex), puesto que se trata de agentes antisépticos los cuales son definidos por Lister en 1984, como sustancias que aplicadas a los microorganismos los hacen inocuos, ya sea matándolos o impidiendo su crecimiento.

En el presente trabajo se pretende:

1. Determinar si S. mutans es sensible a los enjuagues bucales: sanguinarina (Veadent), compuesto fenólico (Listerine) y clorhexidina (Peridex); y
   
   
2. Comparar el grado de efectividad de los enjuague bucales: sanguinarina (Veadent), compuesto fenólico (Listerine) y clorhexidina (Peridex) sobre S. mutans.

De esta forma inferir los beneficios que pueden aportar estos enjuagues bucales como medida de prevención de la caries dental.


MATERIALES Y MÉTODOS:
Esta investigación se llevó a cabo tomando muestras de placa dental humana de lesiones de caries incipientes a nivel de fosas y fisuras de molares y premolares, ya que es la zona donde mayormente se encuentra S. mutans ( Ikeda et al. 1971,1973 ).

Las muestras se obtuvieron de 20 pacientes, los cuales suspendieron la higiene bucal durante 24 horas y 2 horas después del desayuno se enjuagaron con agua para la toma de la muestra, la cual se realizó con un explorador estéril aislando la zona con rollos de algodón y eyector de saliva utilizando espejo bucal y pinza algodonera ( Ikeda et al. 1973).

Dichas muestras se colocaron inmediatamente en tubos de ensayo que contenían 1ml. de solución Ringer para el mantenimiento de las bacterias, se hizo la dispersión de la muestra con un vortex, durante 30 segundos para obtener una muestra homogénea, con la cual se realizó la siembra con asa de alambre en medios específicos.

1. Aislamiento de S. mutans: Gold et al. en 1973, describen un medio selectivo para el aislamiento de S. mutans de la placa dental humana.
   
   Este consiste en la modificación de "agar mitis-salivarius", añadiéndole 0,2 U/ml. de bacitracina y aumentando la concentración de sacarosa en un 20%. A estas concentraciones los agentes selectivos permiten el crecimiento de S. mutans con una máxima inhibición de la restante flora estreptococcica. En ocasiones se pueden presentar enterococos y levaduras, en muestras no diluidas de caries avanzadas en dentina, saliva o muestras del dorso de la lengua. Las colonias de enterococos se presentan azul oscuras y planas, mientras que las levaduras aparecen como colonias grandes, blancas o ligeramente azul mate, todas fácilmente diferenciadas de las colonias de S. mutans (Gold et al.1973), que se presentan de forma circulares o irregulares, de un tamaño entre 0.5 y 1 mm de diámetro, elevadas y que algunas veces presentan una gota de polisacáridos extracelulares brillante en la parte superior o a un lado (Nolte,1985; Maiden et al. 1992).
   
   1.1. Preparación del medio de cultivo: El medio se preparó de la siguiente forma (Gold et al. 1973): Para 1.000 ml. de agar mitis-salivarius, se añadieron 150 grs. de sacarosa, el medio se calentó para disolver los componentes y se sometió a esterilización a 121^oC, durante 15 minutos; al enfriarse el medio a 45^oC se añadió 1 ml. de cada solución estéril (1% de telurito de potasio y 200 U/ml de bacitracina), la fiola con el contenido se agitó para mezclar, sin producir espuma.
   
   Las placas de Petri conteniendo 20 ml. del medio se dejaron secar durante 24 horas a temperatura ambiente, una vez secas, se mantuvieron en refrigeración hasta ser utilizadas. Es importante recordar que la bacitracina es estable sólo por una semana, manteniendola refrigerada.
   
   1.2. Siembra de la muestra: Se procedió a la siembra de la muestra sobre el agar MSBS (mitis-salivarius-bacitracina-sacarosa), extendiéndola con una asa de alambre, de manera de obtener un crecimiento bacteriano uniforme.
   
   Una vez realizada la siembra, las placas fueron incubadas en condiciones anaeróbicas (atmósfera de 95% nitrógeno, 5% dióxido de carbono ), en jarras para anaeróbiosis con su respectivo sobre generador de anaerobiosis y su indicador, a una temperatura de 37^oC durante las primeras 24 a 48 horas seguido de 24 a 48 horas a temperatura ambiente (Hamada et al. 1980).
   
   1.3. Identificación: La identificación morfológica se hizo al microscopio óptico, después de realizada la coloración de Gram, para la cual se prepararon frotis en láminas porta objeto y posterior coloración utilizando: violeta de genciana oxalatada o fenicada, solución de safranina, solución mordiente; lugol y solución decolorante alcohol-acetona. Es importante recordar que S. mutans es Gram + y al microscopio óptico se observó la morfología ovoide y elongada de las células, dispuestas en pares o cadenas cortas, característico de S. mutans.
   
   Para la identificación bioquímica a las colonias que se les realizó la identificación morfológica, se procedió a realizar las pruebas con los azúcares (manitol y sorbitol ), las cuales se incubaron en anaeróbiosis a 37^oC y se observaron a las 24, 48 y 72 horas. Se determinó la producción de ácido al variar el color del indicador (rojo fenol ), el cual cambió de rojo a amarillo (Power et al. 1988).
   
   La fermentación de ambos azúcares se obtuvo de un sólo tipo de colonia y de un sólo paciente de los que se tomó la muestra.
   
   Las pruebas de fermentación del sorbitol y el manitol se utilizaron para diferenciar los estreptococos del grupo mutans de las otras especies de estreptococos bucales.
   
   La prueba de la catalasa se realizó colocando una gota de inóculo sobre una lamina porta objeto y agregándole una gota de peróxido de hidrogeno al 30%. La positividad de la prueba se comprueba por la efervescencia en la reacción. En nuestro caso la prueba resultó negativa.
   
   Dentro del grupo de estreptococos mutans pudimos diferenciar a S. mutans de S. sobrinus por la respuesta negativa a esta prueba, la cual para S. sobrinus suele ser positiva (Maiden et al. 1992).
   
   
2. Prueba de Sensibilidad: Una vez identificada la bacteria, se preparó un inóculo de turbidez 0.5 Mac Farlan (Power et al. 1988).
   
   Con dicho inóculo se sembraron 30 placas de Petri en medio "agar mitis-salivarius", sobre el cual se dispensaron los discos de papel de filtro preparados con cada enjuague bucal snguinarina (Veadent), compuesto fenólico (Listerine) y clorhexidina (Peridex ).
   Las 30 placas de Petri se dividieron en tres partes identificándose cada parte con la inicial del producto.
   
   Los discos de papel de filtro estéril de 1/4 de pulgada se repartieron en tres placas de Petri estériles, una para cada enjuague bucal. Luego se le agregaron 20 Ul. (microlitros) de enjuague a cada disco y antes de colocarlos sobre el medio de cultivo se pasaron por un papel de filtro estéril para absorber el exceso de enjuague.
   
   Una vez realizada la siembra y colocados los discos, las placas de Petri se incubaron en condiciones anaeróbicas en jarras para anaerobiosis a 37^oC durante 48 horas y luego 48 horas a temperatura ambiente.
   
   Pasado el tiempo mencionado se abrieron las placas para realizar la medición de los halos de inhibición, lo cual indicó la mayor o menor sensibilidad de la bacteria a los enjuagues bucales: sanguinarina (Veadent), compuesto fenólico (Listerine ) y clorhexidina (Peridex).

RESULTADOS:
Los resultados obtenidos en esta investigación demuestran que S. mutans no fue sensible a los enjuagues bucales: sanguinarina (Veadent) ni compuesto fenólico (Listerine), ya que dichos enjuagues no inhibieron su crecimiento, en las pruebas realizadas. Por el contrario, sí fue sensible al gluconato de clorhexidina (Peridex).

Se observó claramente el crecimiento de S. mutans sobre los bordes de los discos que contenían sanguinarina (Veadent) y compuesto fenólico (Listerine) . Alrededor de los discos impregnados con gluconato de clorhexidina (Peridex), se observó perfectamente la inhibición del crecimiento de S. mutans, el cual se produjo en un 90% de las pruebas efectuadas, para los cuales se calculo la media del halo de inhibición y fue de 8.2 mm.

Para los enjuagues bucales sanguinarina (Veadent) y compuesto fenólico (Listerine) los resultados obtenidos fueron de 0 mm. ya que no hubo formación de halo de inhibición.


DISCUSIÓN:
A través de los resultados obtenidos en esta investigación se pudo demostrar que S. mutans no es sensible a los enjuagues bucales, sanguinarina (Veadent) ni compuesto fenólico (Listerine), pero sí al gluconato de clorhexidina (Peridex).

Los enjuagues bucales mencionados anteriormente han demostrado ser efectivos en el control de la placa y se pensó que podían tener algún efecto sobre la caries dental, ya que la placa dental es uno de los factores etiológicos principales en esta enfermedad. Y a la vez tener algún efecto sobre S. mutans, uno de los principales microorganismos que intervienen en el inicio del proceso carioso, ya que presenta un potencial para producir caries superior al de cualquier microorganismo acidógeno de la placa supragingival.

Además esta bien documentado que si los estreptococos del grupo mutans son reducidos o eliminados de las superficies de los dientes infectados el riesgo de caries puede ser controlado.

En lo que se refiere a otros estudios, no hay información sobre el efecto del enjuague bucal sanguinarina (Veadent) sobre la caries dental, pero sí su efecto en la reducción de la acumulación de placa, como se mencionó al inicio ( Southard et al. 1984; Lindhe, 1984). Aunque Mauriello y Bader en 1988; Moran et al en 1988 y Quirynen et al en 1990, indican que su efecto es limitado.

Eisenberg et al. en 1991, realizaron un estudio in vitro donde determinaron que el enjuague bucal (Veadent) tiene un efecto inhibitorio sobre S. mutans y otros microorganismos, lo que difiere con los resultados obtenidos en esta investigación en la cual el enjuague no produjo inhibición del crecimiento de dicho microorganismo lo que quizás se deba a diferencias, en cuanto al método utilizado.

En lo que respecta al enjuague bucal, compuesto fenólico (Listerine), ha sido demostrado su efecto significativo en la reducción de la acumulación de placa dental y gingivitis ( Walker 1988; Mandel 1988).

En cuanto a su efecto sobre el S. mutans, Minah et al. 1985; Goldner et al. 1986,determinaron in vitro que el Listerine destruye a S. mutans a los 30 seg (citado por Clinical Review Listerine antiseptic, 1988), lo cual difiere con los resultados de esta investigación donde S. mutans no mostró sensibilidad al enjuague bucal Listerine antiséptico, lo que pensamos se deba a variaciones en la metodología utilizada.

En lo que se refiere al enjuague bucal gluconato de clorhexidina (Peridex), los resultados obtenidos coinciden con los de otros estudios.

Loe en 1976, en un estudio clínico durante 2 años utilizando clorhexidina como enjuague bucal, observó que en los pacientes que presentaban S. mutans, dichos microorganismos habían disminuido durante el tratamiento. Es de hacer notar que a pesar de que nuestro estudio fue in vitro, los resultados fueron similares, ya que se demuestra en ambos que S. mutans es sensible al gluconato de clorhexidina.

Posteriormente Hennessey en 1977 y Roberts et al. en 1981, demostraron que aislado individualmente, S. mutans es sensible al gluconato de clorhexidina y es inhibido por 1 a 20 Ug/ml.; al igual que en nuestra investigación, los resultados demuestran el efecto inhibitorio del gluconato de clorhexidina sobre S. mutans.

Por otra parte se han hecho estudios sobre el efecto del gluconato de clorhexidina sobre la caries dental, Regolati et al. 1969, en un estudio clínico demostraron que la caries en fisuras y superficies lisas es inhibida de una forma significativa con la utilización de clorhexidina.

Mas tarde Loe et al. 1972, evaluaron el gluconato de clorhexidina como agente anticaries, debido a su efecto inhibitorio en la formación de placa, y reportaron una reducción significativa del porcentaje en el incremento de caries dental.

Los resultados de esta investigación, se pueden explicar quizás por el efecto de este enjuague antibacteriano sobre los estreptococos del grupo mutans, los cuales se han considerado los más sensibles al gluconato de clorhexidina comparada con otros estreptococos que colonizan la placa.

Aunque su uso prolongado se ve limitado, por su gusto amargo y desagradable y las posibilidades de manchar los dientes y restauraciones estéticas. Weyne en 1991, refiere que el uso de sustancias antimicrobianas como clorhexidina esta indicado en pacientes muy infectados con estreptococos cariogénicos.

No obstante, Hennessey en 1977, refiere que la acción de los antisépticos, especialmente la clorhexidina, puede afectarse por la presencia excesiva de proteínas a nivel de la saliva y la placa bacteriana, las cuales pueden ser absorbidas por el antiséptico, lo que limitaría su acción.

También hay que tomar en cuenta la influencia del pH en el efecto antimicrobiano de los antisépticos, ya que su máxima efectividad se obtiene a pH específicos (Hennessey, 1977).

Es importante destacar la posibilidad de que el efecto de los antisépticos utilizados se haya afectado por la absorción de las proteínas presentes en el medio de cultivo, ya que la presencia de material orgánico puede reducir el efecto de los antisépticos en general, aunque en el caso de los fenoles el efecto antiséptico se ha visto poco afectado por la presencia de material orgánico (Litter,1984). Por tanto se sugiere la realización de otros estudios in vitro y estudios in vitvo para corroborar los resultados obtenidos en esta investigación.


CONCLUSIONES:

• El enjuague bucal gluconato de clorhexidina (Peridex), fue capaz de inhibir el crecimiento de S. mutans en las pruebas realizadas.
  
  
• El enjuague bucal , sanguinarina (Veadent) no fue capaz de inhibir el crecimiento de S. mutans en las pruebas realizadas.
  
  
• El enjuague bucal compuesto fenólico (Listerine ), no fue capaz de inhibir el crecimiento de S. mutans en las pruebas realizadas.
  
  
• La utilización del enjuague bucal gluconato de clorhexidina (Peridex), puede tener un efecto preventivo sobre la caries dental.

RECOMENDACIONES:

• Se recomienda la realización de otros estudios in vitro y de estudios in vivo con los que se pueda corroborar la veracidad de los resultados obtenidos en esta investigación.

AGRADECIMIENTOS:
A la Cátedra de Microbiología de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela y especialmente a la Lic. Aura Pacheco por su invalorable e incondicional ayuda técnica y humana.