Trabajos Originales

Angiogénesis en lesiones premalignas y malignas de la mucosa bucal

Recibido para arbitraje:18/08/2003
Aceptado para publicación:08/12/2003

RESUMEN
Se ha establecido que el crecimiento, la progresión y las metástasis de los tumores sólidos, constituyen procesos dependientes de la angiogénesis (formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de capilares preexistentes). En la mucosa bucal se producen diversas lesiones premalignas y malignas, las cuales se han empleado como un modelo de progresión tumoral. En el presente estudio se determinó la densidad vascular, como una medida de la respuesta angiogénica, en grupos de lesiones con diferentes grados de displasia y carcinomas espinocelulares, mediante la cuantificación de vasos sanguíneos identificados con el Factor VIII de von Willebrand por técnicas de inmunohistoquímica,. Los resultados revelaron un incremento en la densidad vascular con la severidad del diagnóstico. La densidad vascular (media ± desviación estándard) fue menor en el grupo de displasia leve (12.70 ± 3.04), con un progresivo incremento en el de displasia moderada (21.62 ± 1.99), y más significativo aún en el grupo de displasia severa (59.50 ± 8.73) y carcinoma espinocleular (60.62 ± 8.74). Sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p= 0,05) en la densidad vascular entre la displasia leve y moderada, ni entre la displasia severa y los carcinomas espinocelulares. Estos hallazgos sugieren que la angiogénesis, posiblemente ocurre tempranamente en el desarrollo de la carcinogénesis oral, principalmente en la displasia severa y carcinoma.

Palabras Claves: angiogénesis, displasia, carcinoma espinocelular, densidad vascular, inmunohistoquímica.

ABSTRACT
It has been established that growth, progression and metastasis of solid tumors are processes angiogenesis-dependent (new blood vessels formation from preexistent capillaries). Several kind of premalignant and malignant lesions in the oral mucosa, has also been used as a model of tumor progression. In the present study we determined the vascular density, as a measure of the angiogenesis response, in groups of lesion with differents grade of dysplasia and squamous carcinomas, through the quantification of blood vessels identified with the von Willebrand Factor VIII by immunohistochemistry techniques. Results revealed an increase in the vascular density with the diagnosis severity. The vascular density (media ± standard deviation) was lower in the group of mild dysplasia (12.70 ± 3.04), with a progressive increase in the moderate dysplasia (21.62 ± 1.99), and furthermore significative in the group of severe dysplasia (59.50 ± 8.73) and squamous carcinoma (60.62 ± 8.74). However, no statistically significant differences (p= 0.05) were found in the vascular density either between mild and moderate dysplasia, or severe dysplasia and squamous carcinoma. These findings suggest that the onset of angiogenesis, possibly occur early in the development of the oral carcinogenesis, mainly in the severe dysplasia and carcinomas.

RESUMO
Estabelecesse para baixo que o crescimento, a progressão e o metástasis dos tumores contínuos, constituem processos dependentes do angiogénesis (formação de embarcações de sangue novas dos capilares preexistentes). Na mucosa oral os ferimentos diversos ocorrem pré-malignas e malignas, quais foram usados como um modelo da progressão do tumor. No estudo atual a densidade vascular foi determinada, como uma medida da resposta do angiogénesis, nos grupos dos ferimentos com graus diferentes da displasia e dos carcinomas espinocelulares, por meio da quantificação de embarcações de sangue identificadas com fatorVIII de von Willebrand por técnicas do inmunohistoquímica. Os resultados revelaram um aumento na densidade vascular com severidade do diagnóstico. A densidade vascular (a média (desvio padrão) era menor no grupo ligeiro do displasia (12.70 (3.04), com um aumento progressivo em esse do displasia moderado (21.62(1.99), e destilador mais significativo no grupo severo do displasia (59.50(8.73) e carcinoma a espinocelular (60.62 (8.74). Não obstante, não as diferenças eram estatísticamente significativas (p = 0.05) no a densidade vascular entre o displasia pesa e modera, nem entre o displasia severo e os espinocelulares dos carcinomas. Estes achados sugerem-no angiogénesis, possivelmente acontece cedo no desenvolvimento do carcinogénesis oral, principalmente no displasia severo e no carcinoma.



INTRODUCCIÓN
El crecimiento de las neoplasias más allá de 1 a 2 mm requiere del riego sanguíneo, el cual aporta el oxígeno, los nutrientes y los factores de crecimiento requeridos por las células tumorales para la expansión del tumor. Esta teoría originalmente postulada por Judah Folkman1, ha impulsado dramáticamente el estudio de la angiogénesis en el área oncológica en las últimas dos décadas2.

La angiogénesis o neovascularización, consiste en la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes. La angiogénesis es un proceso complejo en el que se encuentran implicados distintos tipos celulares (células tumorales, células endoteliales, pericitos, macrófagos y otras), factores u hormonas paracrinas, receptores, cinasas, moléculas de señalización y de la matriz extracelular, así como también involucra procesos que comprenden la movilización y la migración de las células endoteliales, los factores proangiogénicos y la reorganización vascular en estructuras tubulares 3,4.

Existen evidencias directas e indirectas que demuestran que el crecimiento tumoral es angiogénesis-dependiente, de esta manera, estudios in vitro han demostrado que el crecimiento tumoral sin nuevos vasos sanguíneos ocurre solamente hasta donde la difusión pasiva de los nutrientes lo permite, igualmente el uso de inhibidores de la angiogénesis suprimen el crecimiento tumoral en estudios in vitro e in vivo 1,2,5. Las células tumorales intervienen en este proceso liberando moléculas reguladoras de la angiogénesis, en tanto que los antagonistas pueden retardar o prevenir el crecimiento tumoral5.

Folkman y col.6, en su estudio en cultivos de células pancreáticas in vitro, de ratones transgénicos, encontraron que la inducción de la angiogénesis constituye un paso importante durante la carcinogénesis, principalmente en la transición desde hiperplasia a la neoplasia. Se ha reportado un aumento en la vascularidad y angiogénesis durante la actividad proliferativa y de transformación de las células epiteliales bucales en el orden de permitir su crecimiento7,8. Asimismo, estudios epidemiológicos han sugerido que la displasia epitelial bucal posee 5 veces mas riesgo de transformación9 . Otros estudios clínicos revelaron que del 10 al 20% de las lesiones displasicas progresan a carcinomas10 y aún cuando no es posible determinar si una lesión displasica progresará a carcinoma, tales datos indican que la comparación entre la mucosa normal, las displasias y los carcinomas bucales pueden ser empleados como modelo de progresión tumoral7,11.

La densidad vascular es una medida importante para determinar la respuesta angiogénica tumoral y así establecer relaciones con la progresión tumoral y el pronóstico en tumores sólidos a nivel de mama, ovario, próstata, colón y otros5.

En el endotelio vascular se encuentran presentes el antígeno relacionado al factor VIII de von Willebrand (F-VIII/vWF), las moléculas de adhesión a las células endoteliales y plaquetas CD31/PECAM, las selectinas E, P y el CD3412. En diversos estudios, tales marcadores se han utilizado para la determinación de la densidad vascular (DV), mediante técnicas de inmunohistoquímica12,13,14. En el presente trabajo se determinó la DV en grupos de displasia en sus diferentes grados y carcinomas espinocelulares, a objeto de relacionarla con la progresión tumoral.

MATERIALES Y MÉTODOS
Las biopsias de (n=23) pacientes, con diagnóstico de displasia leve (DL, n=5), moderada (DM, n=6), severa (DS, n=6) y carcinomas espinocelulares (CA, n=6), fueron obtenidas del Archivo del Laboratorio de Histopatología "Pedro Tinoco" de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela. En ningún caso los pacientes recibieron tratamiento previo, ni se confirmó la presencia de metástasis. Las características clínicas e histopatológicas y la distribución de las biopsias se muestran en la Tabla 1.

Las secciones de 4 mm de grosor correspondientes a las distintas lesiones premalignas y malignas de la mucosa bucal se procesaron mediante la técnica modificada de la inmunoperoxidasa indirecta15 descrita previamente por Tonino y col.14. Brevemente, las secciones fueron desparafinadas y rehidratadas. Posterior al bloqueo de la peroxidasa endógena se realizaron las incubaciones con la soluciones del kit LSAB universal (labelled streptavidin biotin preoxidase) de tres componentes (Dako CA, USA). Para la determinación de la DV se utilizó el anticuerpo policlonal de humano anti-Factor VIII/ vWF (Dako, CA, USA) en una dilución 1:200 en tampón fosfato salino, pH 7,4. La inmunoreacción se detectó con el cromógeno 3-amino-9-etil carbazol (Sigma). El contrate y el montaje se realizó con hematoxilina de Meyer y gelatina glicerinada, respectivamente.

Determinación de la Densidad Vascular.
La DV se determinó de acuerdo al método de Weidner16 descrito previamente por Tonino y col.14. En las secciones las áreas de mayor DV fueron observadas a una magnificación de 100X. La cuantificación de los vasos sanguíneos y de células positivas al anticuerpo anti-Factor VIII/ vWF se realizó en cinco campos de 250X de aumento (área de 0.639 mm2). Los valores se expresaron como la media ± la desviación estándar del número de vasos sanguíneos por mm2.

Análisis Estadístico.
La DV fue comparada entre los distintos grupos de lesiones premalignas y malignas de la mucosa bucal mediante la prueba no-paramétrica de Mann-Whitney con un nivel de significancia de p=0,05.

RESULTADOS
En los distintos grupos de lesiones estudiadas se observó un incremento en la DV. La DV fue menor en el grupo DL (12.70 ± 3.04), con un progresivo aumento en el grupo de DM (21.62 ± 1.99), y más significativo aún en el grupo de DS (59.50 ± 8.73) y CA (60.62 ± 8.74), Tabla 2. La expresión del FVIII/vWF en las DL y DM se observó en los vasos sanguíneos (Figs. 1 y 2), en tanto que en las DS y los CA la expresión de FVIII/vWF se observó no sólo en los vasos sanguíneos, sino también en las células aisladas o grupos de células con apariencia de brotes vasculares (Figs. 3 y 4).

La prueba no-paramétrica de Mann-Whitney reveló que existe diferencia estadísticamente significativa en la DV entre las DL y las DS (p=0.004) y las DL y los CA (p=0.004), así como también se observaron diferencias estadísticamente significativas en la DV entre las DM y las DS (p=0.002) y entre las DM y los CA (p=0.004). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la DV entre las DL y las DM (p=0.052) ni entre las DS y los CA (p=0.699).

DISCUSIÓN
Las propiedades angiogénicas se han descrito en una variedad de condiciones premalignas a nivel de los tejidos que incluyen, la laringe, la vejiga, las mamas, el páncreas y el tracto gastrointestinal. 6, 17, 18, 19,20 Se ha sugerido que la angiogénesis resulta de las alteraciones en el balance entre los factores estimuladores, que incluyen al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), la angiogenina, el factor de necrosis tumoral (TNF-a) entre los más relevantes y los factores inhibidores como angiostatina, talidomida, endostatina y otros21 presentes en el microambiente local del tumor. Adicionalmente a los cambios en la microvasculatura, se ha sugerido que las alteraciones en la expresión de factores reguladores de proliferación celular y apoptosis generan efectos acumulativos que podrían determinar el potencial de crecimiento y el desarrollo tumoral.22 En las lesiones premalignas y malignas de la mucosa bucal se encontró un incremento en la DV con el grado de displasia hasta el de carcinoma, similar a lo descrito en otros estudios7,8,11,13 que establecen una asociación entre el incremento de la vascularización y el proceso de angiogénesis en apoyo a la actividad proliferativa y de transformación de las células de la mucosa.

Las diferencias en la DV entre las lesiones de DL y DS, DL y CA, DM y DS y DM y CA sugieren un aumento significativo con la progresión de la displasia moderada a la severa, en tanto que la DV en esta última es similar a la observada en los CA. Nuestros resultados indican que el aumento de la vascularización, como una medida de la respuesta angiogénica, posiblemente constituye un evento temprano en el desarrollo de la carcinogénesis bucal.

AGRADECIMIENTOS
Licenciado José Torres, por su colaboración en el análisis estadístico
Este trabajo fue financiado por el C.D.C.H. de la UCV (N|° 03.159.2001).


REFERENCIAS
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TABLA N° 1
Estudios de la acción de la Clorexidina en la desinfección de canales radiculares
TABLA N° 1 Estudios de la acción de la Clorexidina en la desinfección de canales radiculares
RA: reborde alveolar; PA: paladar; CA: carrillo.
TABLA N° 2
Densidad vascular en las lesiones premalignas y malignas de la mucosa bucal.
TABLA N° 2 Densidad vascular en las lesiones premalignas y malignas de la mucosa bucal.

LEYENDAS


Fig. 1. Expresión del FVIII/vWF en un vaso sanguíneo de una lesión de displasia leve. Barra= 10 mm.
Fig. 2. Expresión del FVIII/vWF en los vasos sanguíneos de una lesión de displasia moderada. Barra= 10 mm.
Fig. 3. Expresión del FVIII/vWF en los vasos sanguíneos y brotes vasculares (flechas) de una lesión de displasia severa. Barra= 10 mm.
Fig. 4. Expresión del FVIII/vWF en los vasos sanguíneos de un carcinoma espinocelular. Barra= 10 mm.