Trabajos Originales

Recibido para arbitraje:04/10/2004
Aceptado para publicación:01/12/2004

• Giuseppe Anacleto Scarano Pereira, Profesor Titular de Farmacología Aplicada, Curso de Odontología de la Universidad Federal de Paraíba/Brasil, Doctor en Estomatología.
  
  
• Arnaldo Correia de Medeiros, Profesor Titular Biología Molecular, Curso de Biología de la Universidad Federal de Paraíba/Brasil, Doctor en Biología Genética.
  
  
• Maria Sueli Marques Soares, Profesor Titular de Estomatología, Curso de Odontología de la Universidad Federal de Paraíba/Brasil, Doctora en Estomatología.
  
  
• Eduardo Chimenos Küstner, Profesor Titular de Medicina Bucal, Facultad de Odontología, Universidad de Barcelona/España, Doctor en Medicina y Cirugía.
  
  
• Rosimar de Castro Barreto, Profesor Titular de Farmacología Aplicada, Curso de Odontología de la Universidad Federal de Paraíba/Brasil, Doctor en Farmacología
  
  
• Mónica Perdomo Lovera, Alumna Egresada de la Universidad de Carabobo Venezuela , Doctoranda en Odontoestomatología, Facultad de Odontología, Universidad de Barcelona/España.

Correspondencia:
Maria Sueli Marques Soares -
Rua Dr. Francisco Sarmento Meira, 150/101
Bessa - João Pessoa
58035-420 Brasil
Teléfono: (00 55 31) 245 2270 Fax: (00 55 31) 216 7409
E-mail: [email protected]



INTRODUCCIÓN
Los estudios sobre la presencia de microorganismos en la mucosa gástrica se han visto impulsados por el descubrimiento de Helicobacter pylori, realizado por Warren y Marshall en 1982. Este hecho determinó un cambio importante en el abordaje de enfermedades del aparato digestivo y estimuló varias investigaciones sobre esta bacteria como causante de lesiones en la mucosa gástrica y duodenal. La presencia de H. pylori se ha asociado de manera concluyente a distintas formas de gastritis, úlceras pépticas de estómago y de duodeno, adenocarcinoma gástrico y linfoma gástrico de bajo grado originado en tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT)^1,2,3.

La posibilidad de transmisión de H. pylori por vía oral ha traído como consecuencia el surgimiento de diversas investigaciones con el objetivo de identificar la bacteria en cavidad bucal, sobre todo en la saliva, surco gingival, mucosa yugal y placa dental. Para ello se han propuestos varios métodos de laboratorio, entre los que se encuentran el método de la Reacción en Cadena de Polimerasa (RCP o PCR). En la literatura se ha demostrado la implicación de H. pylori en determinadas alteraciones gastrointestinales, al igual que su localización en placa dental. Se sugiere que la placa dental podría ser una fuente de infección o reinfección de la mucosa gástrica por esta bacteria^{2,4,5,6,7,8,9}. En las poblaciones de bajo nivel económico de los países del Tercer Mundo, el 10% de los niños de 2 a 8 años de edad están infectados por H. pylori¹⁰. Costa¹¹ clasifica la infección producida por H. pylori como la segunda infección más prevalente del mundo. Esta infección se puede adquirir en los primeros años de vida, presentándose el mayor número de casos de infección por este micoorganismo a los 4 años de vida, en tanto que el establecimiento definitivo de la infección ocurre a los 7 años de edad. Este autor cree que la presencia del genoma bacteriano en heces, placa dental y saliva demuestra que las principales vías de infección son la oral-oral y la fecal-oral. El formato espiral y la motilidad conferida por los flagelos son considerados esenciales para los rápidos movimientos de H. pylori a través del jugo gástrico en busca de un microambiente más adecuado^12,13.

Tras un período de incubación de la bacteria, la minoría de los pacientes manifiestan dolor epigástrico, vómitos y principalmente hipoclorhidria transitoria, lo que puede generar un ambiente propicio para la proliferación intestinal de patógenos que normalmente serían destruidos por la acidez gástrica¹⁴. Wienholt et al.¹⁵, demostraron que la infección por H. pylori es la principal causa de gastritis en el hombre y que también parece ser un factor que contribuye al desarrollo de úlceras pépticas, estando presente en el 90 a 100 % de los pacientes con úlceras duodenales. Para Tytgat et al.¹⁶, el patógeno se ha adaptado al ambiente del estómago humano, lo que justifica algunas de las complejidades de la enfermedad ulcerosa duodenal. Según Ramos et al.¹⁷, la presencia de tejido linfoide en la mucosa gástrica es prácticamente patognomónica de la infección por H. pylori. Las características de ese tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT) sugiere que la infección podría representar un estímulo para el crecimiento de linfoma MALT gástrico. Parsonnet et al.¹⁸, relacionan la infección por H. pylori con la presencia de úlceras pépticas y resaltan la importancia de la referida bacteria en la etiología del cáncer gástrico.

Para la adecuada comprensión de la asociación de H. pylori con la placa dental, se hace necesaria una breve descripción de cómo se produce la misma. Manson y Eley¹⁹ afirman que algunos segundos después de la limpieza de los dientes, una fina capa de proteína salival, normalmente glicoproteínas, se deposita sobre la superficie de los dientes, restauraciones y prótesis. Esta capa, llamada película adquirida, es lisa, incolora, translúcida y acelular. Se adhiere firmemente a la superficie dentaria y solo puede ser eliminada por una fricción adecuada. Luego de la formación de la película adquirida sobre la superficie dentaria, esta es colonizada por bacterias. En pocas horas, algunas especies de Streptococcus y, posteriormente, de Actinomyces se adhieren a la película, dando inicio así a la etapa de colonización microbiana en la formación de la placa dental. Posteriormente, otros microorganismos colonizan sobre los que ya se encuentran previamente adheridos a la superficie de la película adquirida ( produciéndose así el proceso de Coagregación) y luego se incrementa el espesor de la placa dental (en la etapa de maduración y crecimiento), donde aumenta el número de microorganismos bien sea por multiplicación de los que ya se hallan presentes o por agregación de nuevos microorganismos. Paralelamente a la etapa de colonización microbiana surge la formación de la matriz de la placa, que ayuda a mantener estable la comunidad de microorganismos que conforman en sí la estructura de la misma.

Nguyen et al.⁶ afirman que la detección de H. pylori en placa dental indica que la colonización de esta bacteria no se limita a la mucosa gástrica y que el nicho bucal puede servir como una posible fuente de reinfección de la mucosa gástrica. Para Schein y Meryn²⁰, aún cuando se han empleado diferentes métodos de diagnóstico para identificar a H. pylori en placa dental, tan solo algunos parecen ser realmente capaces de detectar la presencia de esta bacteria en las muestras clínicas de la cavidad bucal.. Para Cheng et al.⁷, aún cuando la placa dental presente una microbiota bastante compleja, podría actuar como uno de los principales reservorios de H. pylori y posiblemente desempeña un papel importante en la instauración de la infección periodontal y gástrica. Perrone y Berroteran²¹ afirman que la presencia de esta bacteria en la cavidad bucal hace que algunas consideraciones propuestas por los investigadores sean relevantes, entre ellas, la que refiere la presencia de H. pylori en la cavidad bucal como una consecuencia del reflujo gástrico, o como miembro de una microbiota transitoria, o bien como un microorganismo permanente de la cavidad bucal. Se han relacionado varios aspectos odontológicos con la presencia del microorganismo en la placa dental. Los más nombrados son el uso de prótesis dentales y la frecuencia de tratamiento odontológico. Los pacientes que reciben tratamiento odontológico presentan niveles más bajos de seropositividad para H. pylori, mientras aquellos portadores de prótesis dentales permanentes presentan niveles más altos²¹. Según Song et al.²², la placa dental y la saliva se consideran posibles fuentes de infección de H. pylori. Para estos autores, aunque la infección sea fácilmente detectada en el estómago mediante pruebas como la de la ureasa, el examen histológico, el cultivo de microorganismos y la serología, su detección en la cavidad bucal parece ser compleja y puede presentar resultados de positividad que varían del 0 al 100 %.

En la actualidad se han desarrollado técnicas de biología molecular como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), que se basa en la ampliación del ADN bacteriano para constatar la presencia del microorganismo en la placa dental²¹. Song et al.²², investigaron la presencia de H. pylori en placa dental supragingival de molares, premolares e incisivos, en 20 pacientes. Observaron que todos ellos fueron positivos para el ADN de H. pylori en al menos uno de los lugares de recogida de la muestra. Los autores concluyeron que la placa dental realmente actúa como reservorio de esta bacteria.

Para Song et al.²³, los ensayos con PCR demuestran que el método es muy sensible y específico. Lo consideran el método de elección para detectar el ADN de H. pylori en la cavidad bucal. Los mismos autores investigaron la presencia de esta bacteria en la placa dental y en la saliva de 42 pacientes, mediante PCR. Observaron que el ADN de H. pylori se encontraba en la placa dental de 97% de los pacientes y en la saliva del 55% de los mismos. Concluyeron que H pylori puede aislarse y pertenecer a la microbiota normal de la cavidad bucal. Pereira et al.²⁴, identificaron H. pylori , tanto en placa dental como en mucosa gástrica, en cerca de 40% de pacientes con sintomatología dispépticas, incluso cuando el resultado del examen endoscópico fue normal. Por esta razón recomiendan la realización de pruebas para identificar a H. pylori en la cavidad bucal como medio auxiliar de diagnóstico de la infección por este microorganismo.

Teniendo en cuenta la gran prevalencia de H. pylori en pacientes con sintomatología dispéptica y la posibilidad de que esa bacteria sea responsable del desarrollo de alteraciones inflamatorias en la mucosa gástrica, así como, ante el hecho de su presencia en la placa dental representar un probable reservorio de infección y reinfección, es propósito de este trabajo analizar la presencia simultánea de H. pylori en placa dental y mucosa gástrica, con la intención de contribuir al esclarecimiento de si la placa dental es un reservorio bucal de la referida bacteria.

PACIENTES Y MÉTODOS
La muestra de este estudio la constituyeron 48 pacientes, que fueron sometidos a endoscopia digestiva por indicación médica, en un hospital público de la ciudad de João Pessoa/Brasil. En todos los pacientes se registró el motivo de consulta y todos fueron interrogados acerca del consumo de medicamentos, etilismo y tabaquismo. Se registraron también datos sobre los dientes de los que se recogió la placa dental (diente natural o prótesis), los sitios de recogida de la placa dental, así como el área elegida para la toma de fragmentos de mucosa gástrica y el diagnóstico de la endoscopia digestiva. Se consideró como criterio de exclusión el uso de antimicrobianos en los últimos tres meses. No se consideraron criterios de selección del paciente su estado de higiene bucal, sus hábitos alimentarios, nivel socioeconómico, tabaquismo y etilismo. Todos los datos se recopilaron en una ficha clínica. Estos datos fueron tabulados y se sometieron a un análisis descriptivo. El estudio fue evaluado por el comité de ética del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Federal de Paraíba.

Recolección de material de placa dental
La recolección de placa dental se realizó antes de que el paciente fuera sometido a endoscopia digestiva. Para ello se realizó el revelado de la placa en cada paciente usando colorantes convencionales. A continuación se recolectó la placa dental con curetas tipo "Gracey", debidamente esterilizadas en gluteraldehído al 2%. La placa recogida se colocó en un recipiente tipo eppendorf que contenía solución salina (NaCl) al 0,9% . El material se conservó congelado en el laboratorio, para la posterior extracción del ADN bacteriano.

Recolección del fragmento gástrico
Tras la identificación de los pacientes con sintomatología dispéptica y recolección de la placa dental, estos fueron sometidos a endoscopia digestiva. Durante el examen se tomaron muestras de mucosa gástrica lesionada, mediante pinzas endoscópicas. A continuación, los fragmentos fueron colocados en recipientes tipo eppendorf, sin solución, y se conservaron congelados en el laboratorio, para la posterior extracción del ADN bacteriano.

Extracción del ADN bacteriano en la placa dental
Inicialmente se realizó la descongelación de la muestra de placa dental de cada paciente. A continuación se realizó centrifugación durante diez minutos a 7.000 rpm y se descartó la solución salina, seguido de suspensión del pellet celular con 600µL de solución de lisis, conteniendo 3µL de proteinasa K. En una segunda etapa, las muestras se colocaron en baño María a 55ºC durante 3 horas. Tras estas fases, se procedió a la extracción del ADN, añadiendo 600µL de fenol, se agitó durante 1 minuto y centrifugó durante 1 minuto. La fase acuosa se transfirió a otro tubo, y enseguida se realizó la extracción clorofórmica, añadiéndose (600µL) al recipiente, que se agitó durante 1 minuto y se centrifugó durante 1 minuto. Se transfirió la fase acuosa a otro tubo y se continuó con la extracción clorofórmica, añadiendo 600µL de cloroformo al recipiente, que se agitó durante 1 minuto y se centrifugó el mismo período de tiempo. Se pasó la fase acuosa a otro recipiente, se añadieron 300µL de isopropanol frío y fue congelado a una temperatura de -20ºC. En otra sesión, el contenido del recipiente se centrifugó durante 20 minutos a 12.000 rpm y 4ºC. A partir de esta etapa se descartó el líquido, se suspendió en 50µL de H20 de Milli-Q estéril y, finalmente, se pasó a un gel de agarosa al 0,8%.

Extracción del ADN de la mucosa gástrica
Se añadieron 400µL de tampón de lisis en cada una de las muestras de mucosa descongeladas y éstas se colocaron en el vórtex, para centrifugar durante 1 minuto. Se añadieron 10µL de proteinasa K. A continuación, el recipiente fue colocado en baño María a 37º C y se realizó una extracción fenólica (400µL de fenol), agitándose el recipiente durante 1 minuto y centrifugádolo durante 1 minuto más. Tras esta etapa, la fase acuosa se colocó en otro recipiente, añadiendo 400µL de cloroformo y se agitó durante 1 minuto, para realizar posterior centrifugación durante 1 minuto. La fase acuosa se transfirió a otro recipiente, para continuar con nueva extracción clorofórmica (400µL), se repitiron los últimos pasos citados anteriormente. La fase acuosa se colocó en otro recipiente, se añadió 40 µL de acetato de sodio 3M y 1000 µL de etanol absoluto frío. El preparado resultante fue congelado. En una nueva etapa se realizó centrifugación durante 5 minutos, descartó el líquido, se suspendió el ADN en 100µL de H20 Milli-Q estéril y se pasó a un gel de agarosa al 0,8 %.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de H. pylori
Para a identificar a H. pylori se amplió una región específica del ADN ribosomal 16S de la bacteria. Para eso se utilizó un par de iniciadores (primers) denominados HP01 y HP02, cuyas secuencias eron HP01: CTG GAG AGA CTA AGC CCT CC, HP02: ATT ACT GAC GCT GAT TGT GC. Estos iniciadores amplifican un fragmento de bajo peso molecular (109 pares de bases). Para todas las muestras de ADN, provenientes de la placa o de la mucosa gástrica, se preparó una mezcla que contenía cerca de 200mg de ADN total, 50pmol de cada iniciador, el tampón de la Taq polimerasa (Gibco, NY, USA) con concentración final de Tris-HCl 10 mM, pH 8,4, KCl 50mM y MgCl2 3,0 mM, 200µM de cada desoxinucleótido trifosfatado y 2 unidades de Taq polimerasa (Gibco, NY, USA). Las amplificaciones se realizaron con el ciclador térmico MJ Research (NY, USA), utilizando un ciclaje de 30 ciclos con 1 minuto a 92o C, como paso de desnaturalización, 1 minuto a 57oC para unir el primer al ADN y 2 minutos a 72o C como paso de extensión. Tras el ciclaje, los productos amplificados se pasabó a un gel de agarosa al 2%, se sometieron a eletroforesis con 100V, durante aproximadamente 1-2 horas en tampón Tris-Borato, a pH 8,0, en presencia de bromuro de etidio. Tras la eletroforesis, el gel se analizó con luz ultravioleta, para visualizar las bandas cromosómicas amplificadas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se observa en la literatura que los estudios sobre H. pylori abordan el tema de maneras distintas a la adoptada en este trabajo, donde se analizaron los siguientes aspectos:

1) la presencia de H. pylori en mucosa gástrica relacionada con el diagnóstico endoscópico;

2) la presencia de H. pylori en placa dental. La presencia de H. pylori en placa dental en este estudio fue del 100% de los casos estudiados. Estos valores corroboran los resultados de Song y Meryn²⁰, que en 40 muestras de placa dental registraron positividad en todos los pacientes para esta bacteria, mediante PCR. Song et al. (1999)²², también realizaron investigación sobre H. pylori en placa dental de 20 pacientes, obteniendo positividad en todas las muestras. En otro estudio realizado en el año 2000 por Song et al. (2000)²³ estos autores detectaron un 97% de positividad para H. pylori en placa dental de 42 pacientes. Los resultados de estos estudios confirman los datos relatados en la literatura revisada, que demuestran la presencia de esta infección en varias regiones del mundo. Aún considerando la presencia de H. pylori en placa dental, se observa en la literatura que la prevalencia de la infección por esta bacteria puede variar de 0% al 100%. Se ha percibido que los resultados de algunos autores como Schein y Meryn²⁰ y Song et al.²² dependen del método de identificación elegido. Perrone y Berroteran²¹ recomiendan la Técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), con amplificación del ADN bacteriano, que resulta en una mayor especificidad, hecho que justifica la técnica utilizada en este trabajo.

En la muestra de este trabajo, 9 pacientes usaban prótesis dentales y todos presentaron positividad para H. pylori en placa dental; 6 pacientes también presentaron positividad en mucosa gástrica. Este dato corrobora con la afirmación de Perrone y Berroteran²¹ quienes acreditan que los portadores de prótesis dentales presentan niveles altos de infección por H. pylori.

En este estudio el 100% (n=48) de los pacientes presentaron positividad para H. pylori en placa dental, independientemente de la presencia de lesión en la mucosa gástrica. En la mucosa gástrica de los pacientes estudiados el 66,67% (n=32) presentaron positividad para H. pylori y 6 (33,33%) casos fueron negativos (Fig. 1). La elevada positividad de esta bacteria en la mucosa gástrica, en este estudio, viene a confirmar los resultados de varios estudios de otros autores, que describieron la presencia de este microorganismo en mucosa gástrica. Un ejemplo es el estudio de Elizalde et al.²⁵, quienes estudiaron a 164 pacientes adultos con sintomatología digestiva y registraron 120 (73,3%) casos positivos para H. pylori.

En el presente estudio, 6 pacientes (12,5%) presentaron diagnóstico endoscópico normal. Sin embargo, en 42 pacientes (87,5%) se diagnosticó alguna lesión en el aparato digestivo (Fig. 2). En la tabla 1 se presentan los casos en que hubo diagnóstico de endoscopia digestiva con lesiones en el aparato digestivo. Se observa que la infección simultanea en placa dental y mucosa gástrica ocurrió en mayores percentajes cuando los pacientes presentaron alguno tipo de lesión gástrica. La positividad concomitante de H. pylori, en mucosa gástrica y placa dental fue del 69% en los pacientes con gastritis, del 80% de los con úlcera y del 78% en los con gastritis asociada a otra patología gástrica. En los pacientes con endoscopia normal (sin patología) se observaron simultáneamente la presencia de H. pylori en placa dental y mucosa gástrica en 50% de los casos. Se supone que la presencia de lesión en la mucosa gátrica favorece la proliferação de H. pylori en el medio y consecuentemente aumenta la colonización de la mucosa gástrica por el patógeno. Se hace creer que la infección de la mucosa gástrica por H. pylori freceuntemente ocurre con presencia simultánea del patógeno en la placa dental. Se creer también que la alta positividad de H. pylori en placa dental (100%) es un indicativo de que esta es un reservorio de esta bacteria.

CONCLUSIONES
De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio y considerando las condiciones en que el mismo fue realizado se puede concluir que:

1. En la mayoría de los pacientes con alteraciones gastrointestinales, hubo infección por Helicobacter pylori tanto en placa dental como en mucosa gástrica;
   
2. La presencia de H. pylori en placa dental puede considerarse un posible medio de infección y reinfección de la mucosa gástrica;
   
3. La realización del método PCR aplicado en placa dental podrá servir como recurso auxiliar de diagnóstico en la infección por H. pylori en las gastropatías.
   
4. Hubo mayor frecuencia de infección concomitante en placa dental y mucosa gástrica cuando havía lesión gastointestinales.