Trabajos Originales

Actividad de fosfatasa ácida en tejidos de camundongos inmunes de gérmenes y convencionales

  • Daniel Penna e Souza, Estudiante de graduación de la Facultad de Odontología de la Universidad Federal de Minas Gerais Estudiante de Graduación

  • Flávio Juliano Garcia Santos Pimenta, Estudiante de graduación de la Facultad de Odontología de la Universidad Federal de Minas Gerais

  • Maria Esperanza Cortés, Profesora Adjunta - PhD - Departamento de Odontología Restauradora de la Universidad Federal de Minas Gerais

  • Vagner Rodrigues Santos, Profesor Adjunto – DDS-PhD - Departamento de Clínica, Patología y Cirugía de la Universidad Federal de Minas Gerais
    Laboratório de Microbiologia- Facultad de Odontologia
    Universidad Federal de Minas Gerais – Belo Horizonte- Brasil
Recibido para arbitraje: 29/01/2002
Aprobado para publicación: 01/03/2002

Agradecimientos
El Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq - Brasil); Fundação de Assessoramento à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG-Brasil), al Prof. Enio Cardcilio Vieira, Prof. Jacques Robert Nicoli, a la Prof. Jaqueline Alvarez Leite (Instituto de Ciências Biológicas - UFMG), y al Prof. Alfredo José Barbosa (Faculdade de Medicina-UFMG).

RESUMEN
La relación que existe entre la flora microbiana y la actividad de la fosfatasa ácida (FAc) en los tejidos animales es poco conocida y su acción sobre los tejidos orales de animales inmunes de gérmenes (GF) es poco estudiado. El objetivo de este trabajo es verificar la influencia de la flora indígena sobre la actividad de FAc en el masetero, lengua, riñón y hígado de animales GF y convencionales (CV). Fueron seleccionados camundongos con 45 días de edad, machos y hembras: 10 GF y 10 CV. Para el estudio fueron removidos el masetero, la lengua, el riñón y el hígado y posteriormente teñidos histoquimicamente para la actividad de FAc. Análisis de los resultados mostraron la reacción enzimática fuertemente positiva en los animales CV, en cuanto que los tejidos de los animales GF se presentó francamente positiva. Este estudio sugiere que la microbiota indígena es importante para la reacción de FAc observada en los tejidos de los animales estudiados.

Palabras clave: Fosfatasa ácida; camundongos inmunes de gérmenes, camundongos convencionales.

ABSTRACT:
The relationship that exists between the microbial flora and the activity of the fosfatasa (FAc) in the animal tissues it is not very well-known and their action on the oral tissues of immune animals of germs (GF) it is little studied. The objective of this work is to verify the influence of the indigenous flora on the FAc activity in the maseter, tongue, kidney and liver of animal GF and conventional (CV). camundongos was selected with 45 days of age, males and females: 10 GF and 10 CV. For the study the maseter was removed, the tongue, the kidney and the liver and later on colored histochemicaly for the activity of FAc. Analysis of the results showed the strongly positive enzymatic reaction in the animal CV, in reference to the animal tisues GF were presented frankly positive. This study suggests that the indigenous microbiotic flora is important for the reaction of FAc observed in the tissues of the studied animals


INTRODUCCIÓN
La microbiota indígena tiene un efecto regulador muy importante sobre la fisiología del huésped 1, 2, 3, 4, 5, 6. La relación que existe entre la flora microbiana y la actividad enzimática en los tejidos animales es todavía poco conocida y su acción sobre los tejidos orales de animales inmunes de gérmenes (GF) es poco estudiada. La fosfatasa ácida (FAc) (monoéster ortofosfórico fosfohidrolasa – E.C. 3.1.3.2) es del grupo de las fosfomonosterasas específicas que hidrolizan esteres del ácido ortofosfórico en pH ácido 7, 8.

Estudios histoquímicos y cuantitativos de la FAc fueron realizados sobre tejidos de diversos animales de laboratorio 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Esta enzima es observada, en los tejidos, en locales donde se desarrollan procesos de metabolismo elevado 18.

La fosfatasa ácida es considerada um marcador lisosomico19. Esta enzima se encuentra en polimorfonucleares neutrófilos, macrófagos, fibroblastos y linfocitos 20. También fue relacionada con procesos de lisis celular 21, 22, queratinización 12, 23, 24, metabolismo de huesos 25, inflamación26 y en la síntesis y degradación de colágeno27.

Existen relatos sobre la asociación de esta enzima en el mecanismo de defensa y de la poca actividad en el intestino de los animales GF cuando se compara con los animales convencionales (CV)28, 29 . Debido a que los animales GF han mostrado tener un metabolismo diferente de aquellos observados en los similares CV la investigación comparativa con los animales GF y CV, es importante pues permite mostrar la influencia y las funciones de la flora microbiana sobre los diversos sistemas del cuerpo.

Considerando que algunos tejidos animales, como el riñón y el hígado de los ratos CV son utilizados como control positivo para la reacción histoquímica de la fosfatasa ácida, este trabajo tiene como objetivos: verificar a través de la comparación entre los animales GF y CV, la influencia de la flora microbiana sobre la actividad de esta enzima en el músculo masetero, lengua, riñón y hígado y determinar la posible utilización de este tejido como control positivo de coloración para esta fosfatasa.

MATERIAL Y MÉTODOS
Animales: fueron seleccionados 10 (diez) camundongos inmunes de gérmenes (GF) y 10 (diez) camundongos convencionales (CV) Swiss NAE machos y hembras, con 45 días de edad. Estos animales fueron sometidos a anestesia por inhalación de éter y muerte y de ellos fueron removidos el hígado, el riñón, el masetero y la lengua.

Actividad de fosfatasa ácida: los tejidos a ser estudiados fueron inmersos en solución salina tamponada (PBS- 0,01M- pH 7,3) a 4ºC, en seguida fueron condicionados en papel aluminio y guardados en congelador a –82ºC (Congelador Queue – England) hasta el momento de su uso. Los cortes fueron hechos en criostato (Cryostar- England) a –22ºC, con 6 micras de espesura. Análisis de las muestras fueron hechas después de realizada la coloración por hematoxilina y eosina (HE) y por el método histoquimico en duplicata. La técnica de los metales pesados9 fue utilizada para el estudio de la actividad de fosfatasa ácida. Después del periodo de incubación, fueron contra-teñidos con hematoxilina de Mayer y montadas las láminas con gel de glicerina.

La presencia de la actividad fosfatasa ácida fue observada considerando la intensidad de las reacciones: fuertemente positiva (marrón oscuro a negro), levemente positiva (marrón claro), y sin reacción, tanto en el epitelio como en el conjuntivo de los fragmentos observados. Las láminas teñidas por la HE sirvieron para orientar las estructuras de los tejidos.

RESULTADOS
En la Tabla No 1 están presentados los valores de FAc encontrados en los tejidos de ratos GF y CV. Se observa en esta tabla que la FAc se presenta en mayor cantidad en todos los tejidos de animales CV. Por otro lado, las células tubulares renales presentaron reacción fuertemente positiva en todos los grupos de animales testados. En los animales GF la FAc estaba ausente en las células de Kupffer (K), en el hígado, en las fibras musculares del masetero y en todos los tejidos de la lengua con excepción de la camada basal del epitelio (CBE). Además en los animales GF la enzima se mostró levemente positiva en el espacio periportal del hígado. La enzima no fue detectada en la camada de queratina de la lengua tanto en los animales GF como en los CV.

DISCUSIÓN
Desde la publicación de los trabajos de Gomori9 , los métodos originales o modificados para evidenciar fosfatasas fueron usados con éxito por diversos investigadores 12, 13, 30, 31. En lo que se refiere a los animales CV, nuestros resultados fueron similares a los trabajos relatados por Wachstein & Meisel 10 y Thorbeck et al.11. Las células tubulares renales de los animales GF y CV presentaron reacción positiva. El hígado y el riñón son órganos en los cuales ocurre metabolismo elevado relacionado, respectivamente, con el proceso y excreción de la dieta. Esto explica, en parte, la actividad fuertemente positiva de las células de estos órganos para fosfatasa ácida. En el hígado existen las células de Kupffer responsables por la fagocitosis y por lo tanto, son células donde se encuentra un número elevado de lisosomas 11, 17. La reacción que existe entre fosfatasa ácida, pinocitosis y fagocitosis, explica la presencia de esta enzima en células hepáticas y renales donde existen células especializadas en el procesamiento de gotas de lípidos y catabolitos, respectivamente 32.

La actividad de fosfatasa ácida en el masetero y en la lengua de los camundongos GF no fue encontrada en la literatura consultada. El masetero y la lengua están relacionados con elevado metabolismo energético. La lengua está en constante contacto con la microbiota bucal, además de abrigar diversos tipos de microorganismos entre los surcos y papilas. La presencia fuertemente positiva de esta enzima en todas las capas e fases del epitelio de la lengua de los animales CV, sugiere un mayor estímulo de la queratinización por la microbiota bucal, pues en los animales GF la actividad enzimática fue observada levemente positiva solamente en las células basales del epitelio. Este factor llama la atención por el hecho de que la participación de la fosfatasa ácida en la queratinización puede no ser un fenómeno aislado para la presencia de la microbiota oral. La microbiota oral, probablemente, estimula la queratinización como respuesta protectora para el tejido. No obstante, importantes son las variaciones que existen en las reacciones histoquímicas dependiendo de las especies animales estudiadas12 . También hay que tomar en cuenta que la actividad enzimática puede ser suprimida o elevada dependiendo de los tipos de microorganismos asociados a la mucosa del intestino de camundongos 29, 33.

Por otro lado, la actividad de la fosfatasa ácida estuvo ausente en las fibras musculares del masetero y de la lengua de los animales GF, mientras que fue fuertemente positiva en las mismas estructuras de los animales CV. La ubicuidad de esta enzima en los tejidos de animales CV puede reforzar la participación de los microorganismos en la activación de la reacción enzimática.

Concluyendo, nuestros resultados sugieren que la queratinización y actividad de la fosfatasa ácida en los tejidos de los animales GF y CV estudiados, están relacionados con la presencia de la flora microbiana. Desde el punto de vista práctico, el riñón y no el hígado, de los camundongos Swiss NAE inmunes de gérmenes, sirve como control positivo para la tinción histoquímica de la actividad de fosfatasa ácida.
Tabla No 1
Actividad de fosfatasa ácida en tejidos de la cavidad bucal de camundongos convencionales y sin gérmenes.
Tabla No 1 Actividad de fosfatasa ácida en tejidos de la cavidad bucal de camundongos convencionales y sin gérmenes.
Leyenda: K= Células de Kupffer; EP= Espacio Periportal; TR= Células Tubulares renales; FM= Fibras Musculares; E= Epitélio; C= Conjuntivo; CE= Ceratina; CBE= Camada Basal del Epitélio; +++ (fuertemente positiva), + (levemente positiva), - (sin reacción).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
  1. Gordon H.A; Wostmann B.S. Responses of the animal host to changes in the bacterial environment: transition of the albino rat from germfree to the conventional state. Recent Progress. Microbiol. VII International Congress for Microbiology, Symposium V. Stockolm, Almqvist and Wiksells, 1959.
  2. Reddy B.S.; Pleasants J.R.; Wostmann B.S. Metabolic enzymes in liver and kidney of the germfree rat. Biochim. Biophys. Acta (1973); 320: 1- 8.
  3. Dabard J. Axenia, gnotoxenia, haloxenia: definitions and comments. Stal. Sci. Tech. Anim. Lab.(1977); 2: 7-8.
  4. Barros M.C.L.: Influência de algumas bactérias anaeróbias estritas da microflora humana na Doença de Chagas experimental em camundongos gnotoxênicos. Dissertação de Mestrado. Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. 1991.
  5. Santos V.R. Influência de Escherichia coli na Doença de Chagas experimental em camundongos gnotoxênicos e convencionais. Dissertação de Mestrado. Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 1992.
  6. Dick W.A.; Cheng L.; Wang P. Soil acid and alkaline phophatase activity as pH adjustament indicators. Soil Biology & Biochemistry. (2000); 32, 1915-1919.
  7. Knowles J. R. Enzyme-catalyzed phosphoryl transfer reactions. Ann. Rev. Biochem. (1980); 49: 877-919
  8. Lau K.H.W.; Thomas A.B.; Yoo A.; Nguyen J.E.; Wergedal J.E. Int. J. Biochem. (1992); 24, 1815-1824.
  9. Gomori G. Distribution of acid phosphatases in tissues under normal and pathological conditions. A. M. A. Arch. Pathol. (1941); 32: 189-194.
  10. Wachstein M. ; Meisel E. Histochemistry of hepatic phosphatases at a physiologic pH. Am. J. Clin. Pathol. (1957); 27: 13-23.
  11. Thorbecke G.J.; Old L.J.; Benacerraf B.; Clarke D.A. A histochemical study of acid and alkaline phosphatase in mouse livers during various conditions modifying activity of the reticuloendothelial system. J. Histochem. Cytochem. (1961); 9: 392-399.
  12. Itoiz M.E.; Carranza Jr. F.A; Cabrini R.L. Histotopographic distribution of alkaline and acid phosphatases in periodontal tissues of laboratory animals. J. Periodontol. (1964); 35: 470-475.
  13. Halacková Z.; Oudram L.; Kukletová M. Localization of somes enzyme in the periodontium of the rat molar. Acta Histochem. (1980); 67: 173-179.
  14. Lassila V. Effect of occlusal disorder on the gingiva in rats with experimental arteriosclerosis. Enzyme histochemical and biochemical study. Acta Odontol. Scand. (1982); 40: 443-449.
  15. Tenorio D.; Germain J.P.; Hughes F.J. Histochemical studies of acid and alkaline phosphatases in rat tooth germs with undecalcified resin-embedded specimens. J. Histochem. Cytochem. (1992); 40 (8): 1229- 1233.
  16. Kamalia N.; McCulloch C.AG.; Tenenbaum, H.C.; Limeback, H. Direct flow cytometric quantification of alkaline phosphatase activity in rat bone morrow stromal cells. J. Histochem. Cytochem. (1992); 40: 1059-1065.
  17. Safadi A.; Livne E.; Reznick Z. Characterization of alkaline and acid phosphatases from skeletal muscles of young and old rats. Archives of Gerontology and Geriatrics. (1997); 24: 183-196.
  18. Ten Cate A.R. The distribution of acid phosphatase , non-specific esterase and lipid in oral epithelia in man and the Macaque Monkey. Arch. Oral Biol. (1963); 8: 747-753.
  19. Cimasoni G. Crevicular fluid updated. New York, S. Karger, (1983) : 111.
  20. English D.; Martin M.; Harvey K.A.; Akard L.P.; Allen R.; Widlanski T.S.; Garcia J.G.; Siddiqui R.A. Characterization and purification of neutrophil ecto-phosphatidic acid phosphohydrolase. Biochem. J. (1997); 324: 941-950.
  21. De Duve C.; Wattiaux R. Functions of lysosome. Ann. Rev. Physiol. (1966); 28: 435-492.
  22. Olea M. T.; Nagata T. Simultaneous localization of 3H-Thymidine incorporation and acid phosphatase activity in mouse spleen: EM radioautography and cytochemistry. Cell Mol. Biol. (1992); 38: 115-122.
  23. Cabrini R. L.; Carranza F. A. Jr. Histochemical distribution of acid phosphatase in human gingiva. J. Periodontol. (1958); 29: 34-37.
  24. Perry D.K.; Stevens V.L.; Widlanski T.S.; Lambeth J.D. A novel ecto-phosphatic acid phosphohydrolase activity mediates avtivation of neutrophil superoxide generation by exogenous phosphatic acid. J. Biol. Chem. (1993); 268: 25302-25310.
  25. Krane S. M.; Potts J. T. Jr. Skeletal remodeling and factors influencing bone and bone metabolism. In: Harrison’s Principles of Internal Medicine, 9th ed., ed. (1980).
  26. Larmas L. A. A comparative enzyme histochemical study of hydantoin induced hyperplastic and normal gingiva. Proc. Finn. Dent. Soc. (1977); 73: Suppl I. 1977.
  27. Yajima T. Acid phosphatase activity and intracellular collagen degradation by fibroblasts in vitro. Cell. Tissue Res. (1986); 245: 253-260.
  28. Jervis H.R.; Biggers D.C. Mucosal enzymes in the cecum of Conventional and Germfree Mice. Anat. Rec. (1964); 148: 591- 595.
  29. Kawai Y; Morotomi M. Intestinal enzyme activities in Germfree, Conventional, and Gnotobiotic Rats associated with Indigenous Microorganisms. Infect. Immun. (1978); 19: 771- 778.
  30. Santos V.R.. Localização de fosfatase ácida nas vertentes interna e externa da parede não mineralizada da bolsa periodontal supra-óssea de humanos. Arq. Centro Est. Curso Odont. (1996); 31: 64.
  31. Santos V. R.; Souza, D. P. Atividade de fosfatase alcalina em tecidos de camundongos isentos de germes e convencionais. Arq. Odontol. (2001); 36: 139-144. (in português).
  32. Roberts R.Z.; Morris A.J. Role of phosphatidic acid phosphatase 2a in uptake of extracellular lipid phosphate mediators. Biochimica et Biophysica Acta. (2000); 1487: 33-49.
  33. Morris J. B.; Symanowicz P.; Sarangapani R. Regional distribution and kinetics of vinyl acetate hydrolysis in the oral cavity of the rat and mouse. Toxicol. Lett. (2002); 126: 31-39.