Recibido para Arbitraje: 05/08/2015
Aceptado para publicación: 10/11/2015
Los bisfosfonatos son inhibidores de la resorción ósea y aumentan la densidad mineral del hueso. El fluoruro estimula la formación e incrementa el volumen del hueso. Objetivo: Estudiar el efecto del tratamiento combinado de alendronato (AL) y de Monofluorfosfato de sodio (MFP) sobre la regeneración tisular de cavidades óseas neoformadas. Materiales y métodos: Se usaron dosificaciónes de 0,5 mg/kg para AL y de 5mM para MFP. 64 ratas machos Wistar de peso 160 ± 20 g, se dividieron en 4 grupos. El primero actuó como control (C), recibiendo 0,3 ml/100g de peso corporal de solución salina vía subcutánea. El segundo (AL) recibió 0,5 mg de AL/Kg de peso corporal de por vía subcutánea. El tercero (MFP) fue tratado con MFP en el agua de bebida. El cuarto (AL+MFP) recibió tratamiento combinado con AL y MFP. Se obtuvieron muestras de fémur en tiempos 15, 30, 60 y 90 días, para ser sometidas a ensayos biomecánicos. Los estudios estadísticos se realizaron a través del análisis de la variancia. Resultados: Los ensayos biomecánicos determinaron un aumento de la rigidez para AL a los 60 días, así como también para AL y MFP a los 90 días. Tanto los tratamientos con AL, MFP y la combinación de ambos no resultaron estadísticamente significativos cuando se analizaron las variables biomecánicas de fuerza de fractura, energía absorbida y fuerza máxima soportada. Conclusiones: El hecho de que se hayan encontrado diferencias significativas en los ensayos biomecánicos, pone de manifiesto la acción sistémica de los fármacos y no localizada.
Palabras clave: Bisfosfonatos, alendronato, MFP, ensayos biomecánicos.
Bisphosphonates are inhibitors of bone resorption and increase bone mineral density. Fluoride stimulates the formation and increases bone volume. Objective: To study the effect of combined treatment with alendronate (AL) and sodium monofluorophosphate (MFP) on tissue regeneration of newly formed bone cavities. Materials and methods: dosage of 0.5 mg / kg for AL and 5 mM were used for MFP. 64 Wistar male rats of weight 160 ± 20 g, were divided into 4 groups. The first served as a control (C), receiving 0.3 ml / 100 g body weight of saline subcutaneously. The second (AL) received 0.5 mg of AL / kg body weight subcutaneously. The third (MFP) was treated with MFP in the drinking water. The fourth (AL + MFP) received combined treatment with AL and MFP. Femur samples were obtained on days 15, 30, 60 and 90 days, to be subjected to biomechanical testing. Statistical studies were performed by analysis of variance. Results: Biomechanical tests resulted in higher stiffness for AL at 60 days, as well as AL and MFP for 90 days. Both treatments AL, MFP and their combination were not statistically significant when the biomechanical variables fracture strength, maximum strength and energy absorption were analyzed supported. Conclusions: The fact that they have found significant differences in the biomechanical tests revealed systemic drug action and not localized.
Key words: Bisphosphonates, alendronate, MFP, biomechanical.
CORRESPONDENCIA: [email protected]
La responsabilidad prioritaria de los huesos es proveer soporte estructural para el cuerpo. En cuanto a esta función, el esqueleto es la base de la postura, de la locomoción, de la resistencia a la carga diaria y de la protección de los órganos internos. La calidad del tejido depende de múltiples factores como la cantidad, conectividad y orientación de las trabéculas, la estructura del colágeno, la densidad mineral y el contenido mineral principalmente 1.
Las fuerzas que pueden actuar sobre el tejido óseo son de tres tipos: tensión, compresión y torsión. Además pueden ser aplicadas de forma perpendicular a la superficie ósea (fuerza normal) o de forma oblicua (fuerza de cizallamiento). Existen dos tipos de parámetros que caracterizan la biomecánica ósea, aquellos que definen la función del hueso y aquellos que describen la calidad del material óseo2.
Cuando se aplica una fuerza perpendicular, los huesos largos (constituidos mayoritariamente por tejido óseo compacto) responden a las fuerzas aplicadas sobre su superficie siguiendo un patrón característico representado en una curva de fuerza versus desplazamiento. La primera fase es elástica y depende de la rigidez del hueso (fase 1). En esta fase, la deformación es temporal y se mantiene solo durante el tiempo de aplicación de la fuerza tras lo cual, el hueso recupera su forma original. Si la fuerza aumenta, se entra en una fase plástica y el hueso, aunque se recupera parcialmente, queda deformado (fase 2). Por último, cuando la fuerza aplicada es superior a la resistencia del tejido se produce la fractura (fase 3) 3.
La avidez con que los bifosfonatos se unen a los cristales de hidroxiapatita y previenen su disolución fue evidenciada cuando el sitio R1 de su estructura química fue modificado para introducirle un grupo hidroxilo (etidronato), o un átomo de cloro (Clodronato). Estas modificaciones aumentan la afinidad por el calcio y en consecuencia, la mineralización, de ahí su poderosa capacidad para quelar iones4.
El Monofluorfosfato de sodio (MFP) se comenzó a utilizar por las ventajas sobre el NaF por su mejor tolerancia gástrica y compatibilidad con la coadministración con calcio5. Estudios realizados en ratas demostraron que la farmacocinética del MFP muestra gran diferencia con NaF6. El MFP se absorbe en estómago e intestino, uniéndose a la alfa-2-macro¬globulina plasmática, la que se inactiva y es de-purada por receptores del hueso e hígado. Esta proteína se deposita en hueso, la que es luego metabolizada a péptidos de menor peso molecular y finalmente a fluoruro, determinando una mayor vida media del flúor en el organismo y un efecto sostenido sobre el incremento de la masa ósea7.
Aunque ha sido planteada la hipótesis del uso de drogas que permitan disociar la formación de la resorción ósea, no hay información disponible sobre el uso de Alendronato (AL) administrado en forma subcutánea ni del tratamiento combinado de AL y MFP para utilización en patologías a nivel óseo. De esta manera, el uso concomitante de bifosfonatos y MFP podría ser una alternativa terapéutica para dar respuesta a muchas situaciones clínicas en odontología8.
El Objetivo de esta investigación es el de estudiar el efecto de la administración combinada de AL por vía subcutánea y de MFP por vía oral, sobre la calidad de hueso posterior a la regeneración tisular de cavidades óseas neoformadas.
Se preparó una solución de AL para ser aplicado por vía subcutánea. La fórmula farmacéutica con AL se preparó con una dosificación de 0.5 mg/Kg de peso corporal. El MFP se administró en el agua de bebida. Se prepararon tubos marcados con 0,72 g de MFP en polvo y se disolvió el contenido de cada tubo en 1 litro de agua para obtener una solución 5 mM. Esta solución se preparó en el momento de su utilización debido la inestabilidad del MFP en medio acuoso9. Esto producirá una ingesta de MFP de aproximadamente 40 micromoles de MFP/100 g de peso corporal.
Sesenta y cuatro ratas macho de la línea Wistar de peso 160 ± 20 g se dividieron en 4 grupos de 16 ratas cada uno. El primer grupo actuó como grupo control (C). Los animales de este grupo recibieron semanalmente 0,3 ml/100 g de peso corporal de solución salina por vía subcutánea cercana a la intervención quirúrgica y agua corriente de red como agua de bebida. El segundo grupo (AL) recibió semanalmente 0,5 mg de AL/Kg de peso corporal de por vía subcutánea profunda en el miembro posterior izquierdo. Estos animales tuvieron acceso a agua corriente de red ad libitum. El tercer grupo (MFP) recibió tratamiento con MFP en el agua de bebida durante el tiempo que duró el experimento y en el área de la cirugía recibieron inyección subcutánea de solución fisiológica como el grupo C. El cuarto grupo (AL+MFP) recibió tratamiento combinado con AL subcutáneo y MFP por vía oral en el agua de bebida.
Los animales se mantuvieron en bioterio en jaulas colectivas con alimento balanceado y agua de bebida ad libitum, a una temperatura de 22-26 ºC, con un ciclo luz-oscuridad: 12hs-12hs durante el tiempo que duró el experimento. El manejo de los animales se realizó siguiendo los lineamientos del Nacional Institute of Health (NIH) para el uso y cuidado de animales de experimentación (Publication N. 85-23, Rev 1985).
Al inicio del experimento los animales fueron anestesiados con una solución de ketamina/xilazina en relación 8 mg/1.28mg respectivamente por cada 100 g de peso corporal10,11. Previa asepsia del campo quirúrgico con yodopovidona, se realizó con bisturí Bard Parker y hoja Nº 15 una incisión longitudinal en ambas tibias y se decoló la fascia hasta llegar a exponer el hueso. Con una fresa número 6 y a rotación manual para no producir necrosis ósea, se realizó una cavidad en la parte plana de cada tibia hasta llegar al hueso medular. Dicha cavidad no fue rellenada con ningún material y sólo se reparó por su propio coágulo. Luego de realizada la intervención quirúrgica, se recolocaron los planos en posición y se suturó la herida con hilo reabsorbible.
Se obtuvieron muestras de fémur en tiempos 15, 30, 60 y 90 días, que se incluyeron en solución fisiológica y mantenidos a –20ºC para ser sometidas a ensayos biomecánicos. Los estudios fueron realizados con apoyo de personal del Laboratorio de biología Ósea y Metabolismo Mineral. Se utilizó un equipo diseñado por el departamento de Ingeniería del Laboratorio de Biología Ósea. Consta de una celda de carga que genera un voltaje proporcional a la fuerza aplicada sobre el hueso y el desplazamiento ocasionado por un pistón que tiene un avance de 10 micras por segundo. Los datos de voltaje (en Volt) y los datos de desplazamiento (en mm) son adquiridos por un conversor analógico digital y convertidos a Fuerza (en Newton) con un software específico (Biomedical data adquisition suite 1.0). Este parámetro será utilizado como medida del efecto sistémico producida por las drogas utilizadas
Previa verificación de la distribución normal de las variables utilizadas(Test de Kolmorow Smirnov), la comparación de los datos se realizó por análisis de la variancia (ANOVA) a dos y tres criterios de clasificación (tratamientos: C, AL, MFP, AL+MFP, tiempos de tratamiento: 0, 15, 30 60 y 90 días y tibias: problema y contralateral). Se utilizaron test post-hoc cuando análisis de la variancia detectó diferencias significativas. Dichos test post-hoc fueron el test de Bonferroni y el test de Tukey. Se consideraron diferencias significativas si p<0,01. Este estudio estadístico planteado además permitió determinar si existe asociación entre los efectos de los tratamientos y el tiempo. Tanto para el análisis de datos como para construcción de gráficas y análisis estadísticos se utilizó el software estadístico R.
Se evaluó en un ensayo de flexión a tres puntos la resistencia del hueso cortical en la parte media de la diáfisis del fémur. (Fotografía 1) Se determinó: Energía absorbida hasta el punto de fractura (mJoule); Fuerza máxima soportada (Newton); Fuerza de fractura (Newton); Rigidez (Newton/mm) Las variables mencionadas se evaluaron en los diferentes tratamientos y a lo largo del tiempo (15,30 60 y 90 días).
En la Tabla 1 se puede apreciar que el tiempo como era de esperar fue significativo y se debe al crecimiento del animal, aunque los tratamientos no modificaron la energía absorbida. (ANOVA p=0.071) El tiempo, como en la energía absorbida, fue significativo, pero los tratamientos no afectaron la fuerza máxima. (ANOVA 0.617) (Datos no mostrados). Los tratamientos no afectaron el índice de fractura. (ANOVA p=0.653) (Datos no mostrados).
La Tabla 2 muestra que las variables tiempo y tratamientos fueron significativos. (ANOVA p<0.01). El test post-hoc determinó que la rigidez en el grupo AL fue significativamente mayor que en el grupo C a los 60 y 90 días. El grupo MFP fue significativamente mayor que C a los 90 días. (Test Bonferroni p<0-01)
Se evaluó en un ensayo de compresión la resistencia del hueso trabecular en rodajas de epífisis. (Fotografía 2) Se determinó: Energía absorbida hasta el punto de fractura (mJoule); Fuerza de fractura (newton); Rigidez (newton/mm). Las variables mencionadas se evaluaron en los diferentes tratamientos y a lo largo del tiempo (15,30, 60 y 90 días).
La fuerza de fractura en el grupo MFP fue significativamente mayor que el grupo C a los 15, 30, 60 y 90 días. El grupo AL+MFP fue significativamente mayor a C a los 15 y 30 días, y AL lo fue con respecto a C a los 90 días. (test de Bonferroni p<0.01)(Tabla 3) En la Tabla 4 se observa que la energía absorbida en los grupos AL, MFP y AL+MFP fue significativamente mayor que el grupo C a los 30 días. El grupo MFP lo fue con respecto a C a los 30,60 y 90 días (test de Bonferroni p<0.01) La rigidez en el grupo MFP fue significativamente mayor que C a los 30, 60 y 90 días. El grupo AL+MFP con respecto a C a los 15 días mientras que AL lo fue con respecto a C a los 30, 60 y 90 días. (Datos no mostrados)
Diversas condiciones como el trauma o cirugía de resección de tumores o quistes, retiro de material de osteosíntesis, tratamiento de fracturas o la pérdida de porciones de hueso debido a infecciones producen defectos de tamaños desiguales. Tanto en los defectos óseos críticos como no críticos se busca estimular la reparación completa del defecto de forma más activa que siguiendo el curso normal de la consolidación, mediante la estimulación del tejido óseo por medio de materiales, factores de crecimiento, drogas o trasplantes.
Los modelos animales son indispensables para el estudio de nuevos materiales y estrategias de reparación ósea, en particular los modelos en rata; como el de este trabajo, por ser económico, de fácil manejo y adecuado para diferenciar etapas durante el proceso de reparación ósea desde el punto de vista biomecánico12.
Para valorar el comportamiento biomecánico del hueso existen diferentes tipos de ensayos (tracción, compresión, torsión, flexión a tres y cuatro puntos), pero el ensayo de flexión a tres puntos es el más adecuado para animales pequeños. Aunque el comportamiento mecánico del hueso es complejo, se ha simplificado de diferentes maneras con la finalidad de proponer modelos que se aproximen a su comportamiento “in vivo”. Las propiedades biomecánicas del hueso, no son valores homogéneos que se puedan definir de forma precisa, ello depende de la distribución mineral, características estructurales, variaciones entre individuos y la función del hueso a estudiar13.
Las zonas ideales del esqueleto del animal donde se realizan los ensayos biomecánicos son los cuerpos vertebrales, huesos largos (fémur ó tibia) y cuello femoral. Los huesos largos son importantes porque se componen de hueso cortical puro y están cubiertos de periostio, pudiendo reaccionar por aposición perióstica como el hueso humano. Además el fémur de rata tiene la ventaja, como el del ser humano, de ser gran portador de cargas, por lo cual se lo puede someter a análisis con fuerzas más pesadas14.
Nuestro modelo experimental en fémur de rata Wistar es económico, de fácil manipulación, bajo costo de mantenimiento. Se pretendió analizar en este tipo de hueso largo los posibles efectos sistémicos que tuvieran las drogas, para prevenir efectos adversos en futuros estudios clínicos. Los ensayos biomecánicos en el fémur se realizaron previa limpieza e hidratación de las muestras con solución fisiológica y posterior colocación en freezer a -20 °C para su conservación.
Algunos estudios reportan que las propiedades mecánicas del hueso cambian dependiendo del grado de hidratación, sin embargo no se encontraron diferencias significativas durante los tiempos de hidratación probados (3 y 6 horas) 15. En nuestro trabajo, los ensayos biomecánicos determinaron un aumento de la rigidez para AL a los 60 días, así como también para AL y MFP a los 90 días. En cuanto a la combinación de las drogas, los datos obtenidos no fueron estadísticamente significativos en éste parámetro (Bonferroni p<0,01). Tanto los tratamientos con AL, MFP y la combinación de ambos no resultaron estadísticamente significativos cuando se analizaron las variables biomecánicas de fuerza de fractura, energía absorbida y fuerza máxima soportada.
Una investigación para medir masa ósea en ratas demostró que no hubo diferencias significativas en cuanto a fuerza y rigidez en los animales tratados con AL con respecto al control16. Por otra parte, otros autores demostraron que AL administrado en dosis de 1 mg/kg, impidió la disminución de la densidad mineral ósea y mantiene las propiedades mecánicas del hueso después de la ovariectomía17.
Así mismo, experimentos con MFP en ratas con osteopenia, demostraron una mayor resistencia a la carga de compresión pero una mayor fragilidad a la carga de flexión. Además, la terapia de fluoruro provocó un aumento de la rigidez del hueso debido a la presencia de fluorapatita.18