Trabajos Originales

Recibido para Arbitraje: 28/01/2013
Aceptado para Publicación: 04/06/2013

Camejo Suárez, Ma. V., Profesor Asociado de la Facultad de Odontología de La Universidad Central de Venezuela. Miembro de la Sociedad Venezolana de Endodoncia. Merentes Díaz, E., Profesor Titular de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. Instituto de Biología Experimental, IBE. Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores. Márquez, Ma. L., Profesor Asistente de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. Instituto de Biología Experimental, IBE. Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores. González Blanco, O., Profesor Titular Jubilado de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela.

CORRESPONDENCIA: María Valentina Camejo Suárez. Cátedra de Endodoncia. Facultad de Odontología. UCV. TLF. 605 3834. [email protected]

RECONOCIMIENTO: Quiero expresar mi agradecimiento al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH) de la Universidad Central de Venezuela por el apoyo financiero, a través del Proyecto Individual: PI-7507-2009, necesario para llevar a cabo esta investigación.

INTRODUCCIÓN

Las células madre adultas ofrecen una esperanza para el futuro tanto en medicina como en odontología. Estas células tienen un gran potencial para ser utilizadas en la terapia celular y la ingeniería de tejidos, por su capacidad de regenerar órganos dañados y enfermos. Las células madre son poblaciones de células indiferenciadas, que se definen como células clonogénicas, que tienen dos propiedades: a) la autorrenovación, que es la capacidad de dividirse en más células madre y b) la capacidad de diferenciarse en uno o varios tipos de células especializadas, bajo condiciones apropiadas o señales correctas del micromedio ambiente^1-5. Las células madre se pueden clasificar de acuerdo a su potencialidad, en: totipotentes, pluripotentes, multipotentes y unipotentes4-6. También, se pueden clasificar de acuerdo al tejido de donde se pueden obtener, es decir de acuerdo a su origen, en células madre embrionarias procedentes del embrión y células madre adultas o postnatales procedente de adultos y niños ^5,7.

Las células madre adultas han recibido gran atención, debido al descubrimiento de su capacidad para formar múltiples tipos de células y tejidos, así como también, el hallazgo de estas células en un número creciente de tejidos ⁸. La principal función de las células madre adultas es mantener y reparar el tejido de origen, es decir, en el cual ellas residen ⁹. Ellas tienen la capacidad de renovar las células después de un trauma, una enfermedad o por la edad ¹⁰. En un principio, se pensó que estas células estaban predeterminadas a diferenciarse a un tipo celular procedente de su mismo tejido de origen o de su misma capa embrionaria, sin embargo, se considera la posibilidad que las células madre de tejidos adultos puedan generar tipos de células especializadas de otros tipos de tejido desde el cual ellas normalmente residen y son capaces de diferenciarse funcionalmente a células especializadas procedentes de la misma capa embrionaria o de capas embrionarias distintas a las de su origen. Esta capacidad se conoce como "fenómeno de plasticidad" ^{3,4,6,9,11,12}. Actualmente, la lista de tejidos adultos descritos que contienen células madre adultas está creciendo e incluye, las células madre de la médula ósea, las células madre del líquido amniótico, el cordón umbilical, la sangre del cordón umbilical, las células madre de la sangre periférica, cerebro, la pulpa dentaria, vasos sanguíneos, músculo esquelético, tejido epitelial de la piel y del sistema digestivo, cornea, la retina, el hígado y el páncreas, entre otros ^9,13. En el tejido dentario se han identificado y caracterizado poblaciones de células madre adultas derivadas de la pulpa dentaria, el ligamento periodontal, la papila apical y el folículo dentario. Las células madre de la pulpa dentaria fueron aisladas por primera vez por Gronthos y col.¹⁴, en el 2000, de pulpa de terceros molares retenidos. Los datos presentados en su investigación demuestran que la pulpa dentaria adulta contiene células que son clonogénicas, altamente proliferativas y capaces de regenerar tejido mineralizado, propiedades que las define como células madre. Son células multipotentes, capaces de diferenciarse en varios tipos de células ^14,15. Las células madre mesenquimales de pulpa dentaria exhiben características similares a las células madre mesenquimales de médula ósea¹⁶. por lo que podrían ser consideradas como una alternativa más fácilmente accesible de células madre adultas.

El objetivo general del presente trabajo de investigación es establecer el cultivo de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana.


MATERIALES Y MÉTODOS

1. MATERIAL BIOLÓGICO

1.1. SELECCIÓN DE PACIENTES Y EXTRACCIÓN DENTARIA

Se seleccionaron pacientes jóvenes entre 15 y 24 años de edad, sanos, de ambos sexos, que acudieron a la Clínica de Especialidades Odontológicas CEOMED y al Servicio de Cirugía Bucal del Postgrado de Cirugía de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela, a quienes se les extrajeron quirúrgicamente los terceros molares retenidos por razones de tratamiento. Los pacientes dieron su consentimiento y el protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela. Una vez que los dientes fueron extraídos se colocaron inmediatamente en frascos estériles con medio de transporte para muestras humanas, constituido por medio F12 (GIBCO™) con doble dosis de antibióticos y antimicóticos (GIBCO®) para conservar las condiciones de asepsia y se mantuvieron a 4°C para conservar la viabilidad de las células y las condiciones fisiológicas17. Bajo estas condiciones fueron llevados al Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores del Instituto de Biología Experimental de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela, para el aislamiento de las células madre de la pulpa dentaria humana.

1.2. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE TEJIDO PULPAR

En la campana de flujo laminar horizontal, los dientes se lavaron 3 veces con solución buffer de fosfato (PBS: de las siglas en inglés phosphate buffered solution) frío; luego sobre una placa de Petri se limpió muy bien la superficie de los dientes, eliminando el tejido blando con una cureta y nuevamente los dientes se lavaron con PBS. Seguidamente, se realizó la desinfección de la superficie con una gasa estéril impregnada con solución desinfectante, etanol al 70% ^18,-21 y luego se lavaron con PBS, frío. Posteriormente, a los dientes se les realizó un surco de 0,5 a 1 mm de profundidad²³ a 1 mm por debajo de la unión cemento-esmalte¹⁵ Una vez realizado el surco, los dientes se colocaron en un frasco estéril con medio F12 frío. En los casos de dientes con solo un tercio radicular formado, el tejido pulpar fue retirado por la raíz con zondas barbadas y colocado de inmediato en medio fresco, DMEM ( GIBCO™) - F12 frío. Bajo la campana de flujo laminar vertical, los dientes se fracturaron con un cincel a nivel de la ranura o surco realizado para exponer el tejido pulpar de la cámara¹⁸. El tejido pulpar se separó suavemente de la corona y la raíz ¹⁵ e inmediatamente se colocó en una pequeña cantidad de medio DMEM-F12 frío, sobre una placa de Petri, sin permitir que se secara. Posteriormente, se cortó en trozos pequeños con tijera quirúrgica fina ²⁴.

2. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

El protocolo para el aislamiento se basa en la capacidad de las células madre mesenquimales de adherirse a los discos de cultivo y formar grupos discretos de colonias ²⁴. Para aislar las células, el tejido pulpar se colocó en una mezcla de solución enzimática de 4 mg/mL de colagenasa tipo I (SIGMA) y 2 mg/mL de dispasa (GIBCO™) en una proporción 1:1 por 60 minutos a 37°C. La suspensión obtenida se filtró a través de un filtro de células de 70 µm. Posteriormente, la suspensión celular resultante se centrifugó durante 6 minutos a 500 g, el taco celular obtenido, se resuspendió en el medio nutritivo para células mesenquimales, compuesto por: medio DMEM y F12 suplementado con 15% de SFB (GIBCO™) 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato (Merck), 2 mM L-glutamina (Glutamax; GIBCO®), 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL de anfotericina B (GIBCO®) y fueron sembradas en placas de 4 pozos [1,9 cm2 cada pozo, (NUNC)]. Las células aisladas de la pulpa dentaria, generalmente, son sembradas a una densidad de 0,1 a 1 x 103 células / cm2 ²⁵. La viabilidad celular se determinó con el colorante de exclusión Azul Tripano y se cuantificó el número de células con un hemocitómetro (Cámara Neubauer). Los cultivos fueron incubados a 37°C, en atmósfera húmeda a un 95% de aire y un 5% de CO2. A las 24 a 48 horas se cambió el medio de cultivo, para eliminar los restos de células y células no adherentes ²⁶. Las células se mantuvieron hasta alcanzar la semiconfluencia (80%), con cambios periódicos de medio. Obtenida la semiconfluencia, se procedió a realizar los subcultivos con el fin de amplificar la población de células; para ello las células se disgregaron con tripsina (GIBCO™) a 0,05% y EDTA (SIGMA®) a 0,2%, incubadas por 7 minutos a 37 °C. Las células fueron centrifugadas a 500 g por 6 minutos y el taco celular obtenido se resuspendió en medio de cultivo nutritivo con suero, luego las células fueron contadas en una cámara de Neubauer para sembrar nuevamente.

2.1. CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Para analizar las características morfológicas y el comportamiento in vitro de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, se realizaron observaciones bajo el microscopio invertido de contrate de fases (Olympus I X50) acoplado a una computadora con programa TV Tuner y se tomaron los registros fotográficos correspondientes. El aspecto morfológico se determinó mediante coloración de rutina May-Grünwald-Giemsa.

2.2. EXPRESIÓN DE MARCADORES ANTIGÉNICOS DE SUPERFICIE CELULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA A TRAVÉS DEL ANÁLISIS INMUNOCITOQUÍMICO

Para observar si en las poblaciones de células aisladas y cultivadas in vitro, están presentes células mesenquimales con un fenotipo indiferenciado, se utilizó la expresión de marcadores de superficie característicos de estas células, por métodos inmunocitoquímicos. Los anticuerpos utilizados fueron el anti-STRO-1 y anti-CD146 (MUC18), dos marcadores tempranos de células madre mesenquimales y el anti-CD45, un marcador específico para células hematopoyéticas, cuya expresión debe ser negativa. Las células de los subcultivos, del tercer pasaje, de pulpa dentaria humana fueron sembradas a una densidad de 2 x 10⁴ cel/cm² en placas de 4 pozos y cultivadas durante la noche. Las células fueron lavadas con PBS, pH 7,4, luego se fijaron con metanol por 5 minutos. Una vez transcurrido este tiempo se lavaron con PBS, seguidamente se agregó peróxido de hidrogeno a un 3% por 6 minutos, para inactivar la peroxidasa endógena. Luego se lavó con PBS, se eliminó el exceso de líquido para posteriormente realizar la incubación con el anticuerpo primario monoclonal mouse anti-STRO-1 (1:100; Invitrogen™), el anticuerpo monoclonal anti-CD146 (1:100; eBioscience) y el anticuerpo monoclonal mouse anti-humano CD45 (1: 100; Dako Denmark) por 35 minutos y se lavó con PBS, luego se evidenció la reacción del anticuerpo utilizando el Kit ABC (Vector), se colocó el anticuerpo secundario biotinilado por 30 minutos. Posteriormente se incubó el complejo estreptavidina-HRP por 30 minutos, seguido del lavado con PBS, fresco. Seguidamente, se preparó el sustrato para la peroxidasa, la Diaminobencidina (cromógeno) y se incubó por 5 a 10 minutos. Luego se lavó con agua destilada, varias veces. Por último, se contrastaron los núcleos con Hematoxilina. El Kit ABC usa un anticuerpo secundario biotinilado que se une al complejo estreptavidina- biotina- peroxidasa, el cual reacciona con el sustrato para peroxidasa (Diaminobencidina) produciendo un precipitado marrón que permitió evidenciar la unión antígeno-anticuerpo¹⁹. También se llevaron a cabo las pruebas inmunohistoquímicas en cortes histológicos de una muestra de pulpa dentaria humana, para evidenciar la expresión de estos marcadores, como un patrón de referencia. La muestra fue procesada por procedimientos histológicos de rutina.

2.3. DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE FORMACIÓN DE COLONIAS DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Para determinar la eficiencia de formación de colonias se utilizaron células del tercer subcultivo, sembradas a baja densidad [100 cel 8,8 cm2 (placa de 35mm)], por triplicado, en medio DMEM - F12, suplementado con 15% SFB, 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B. El medio nutritivo se cambió cada 4 días. A los 14 días, se realizó la evaluación de la eficiencia de la formación de colonias^14,18,27. Los cultivos fueron fijados con metanol durante 5 minutos y se colorearon con Giemsa (diluido en una proporción 1: 15 con agua destilada). Grupos > 50 células se contaron como colonias^14,28,29. Gronthos y col.²⁹ en su estudio sobre la caracterización de alta pureza de las células madre mesenquimales de la médula ósea, los agregados > 50 células se contaron como unidades formadoras de colonias, mientras, que los agregados > 10 y < 50 células los contaron como racimos o grupos. De la misma manera fue considerado en la presente investigación. La eficiencia de formación de colonias se expresó en porcentaje, el número total de colonias se dividió entre el número inicial de células sembradas y el resultado se multiplicó por 100. Lo que indica el porcentaje de células capaces de formar colonias ^22,27,30, la capacidad para autorrenovarse y la capacidad de propagación a baja densidad ²⁷.


RESULTADOS

1. AISLAMIENTO, CULTIVO Y CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Bajo las condiciones de aislamiento (disgregación enzimática) y cultivo llevadas a cabo en la presente investigación se establecieron células viables de la pulpa dentaria humana, evidenciado a través del contaje celular y la observación regular de los cultivos, con un microscopio invertido de contraste de fase. Las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, de terceros molares, mostraron un óptimo crecimiento, cultivadas en el medio DMEM-F12, suplementado con 15% de SFB, 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina y 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B (antibiótico-antimicótico), condiciones de cultivo descritas previamente como óptimas, para este tipo de células. El aspecto morfológico y el comportamiento in vitro de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana mostraron inicialmente, en el cultivo primario, que las células aisladas formaron colonias adherentes a partir de los 3 a 5 días, la mayoría de las células presentaron una morfología fusiforme típica de células semejantes a fibroblastos con procesos citoplasmáticos cortos, que gradualmente se extendían (Figura 1), así como, ocasionales colonias de células con morfología parecida a células endoteliales o epiteliales que desaparecieron en el curso de los sucesivos pasajes. Las células del cultivo primario lograron la confluencia a los 6 a 7 días, los subsecuentes subcultivos tendían a tener un acelerado crecimiento, por lo que los cultivos alcanzaban la confluencia en corto tiempo entre 5 a 6 días.

A partir del tercer subcultivo, se obtuvo una población más homogénea (Figura 2), basado en la morfología de las células, características de células semejantes a fibroblastos con extensiones citoplasmáticas, núcleo ovalado, central con varios nucléolos, que permanecieron hasta el decimo octavo pasaje. Sin embargo, se pudo evidenciar que la mayor proliferación celular se observó entre el sexto, séptimo y octavo subcultivo. Se observó que en el sexto y séptimo subcultivos además de la gran proliferación celular, la formación de agregados de células, del cual se irradian las células paralelas unas a otras. Las células cercanas al agregado celular se observan estrechamente unidas y pierden su morfología fusiforme y adquieren una morfología cuboides, posiblemente asociado a una diferenciación espontanea hacia el linaje osteogénico. (Figura 3). Mientras que en el resto del cultivo las células conservaron su morfología fusiforme semejante a fibroblastos. En los siguientes subcultivos no se observaron aparentemente cambios morfológicos de las células asociados a la diferenciación y senescencia.

2. EXPRESIÓN DE MARCADORES ANTIGÉNICOS DE SUPERFICIE CELULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA A TRAVÉS DEL ANÁLISIS INMUNOCITOQUÍMICO

La identificación de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana a través del análisis inmunocitoquímico de los cultivos de las células mesenquimales de la pulpa dentaria, se realizó utilizando los anticuerpos anti-STRO-1, anti-CD146/MUC18 y el anti-CD45. Las células aisladas de la pulpa dentaria de terceros molares, del tercer pasaje, expresaron moléculas de superficie celular STRO-1 (marcador de células mesenquimales) y CD146/MUC18 (marcador de células endoteliales) "positivas", considerados dos marcadores tempranos de células madre mesenquimales, mientras el marcador específico para células hematopoyéticas, el CD45 (antígeno común de leucocitos) fue "negativo". La ausencia de expresión de este marcador, indica que en las células aisladas de la pulpa, no están presentes progenitoras hematopoyéticas. Se demuestra que estas células no derivan de fuentes hematopoyéticas sino son de origen mesenquimal. Estos resultados fueron consistentes para las distintas líneas celulares. Las células "positivas" a las moléculas de superficie STRO-1 y CD146/MUC18 en las poblaciones de células aisladas, expresaron diferentes niveles de intensidad de expresión desde leve, moderada e intensa. Los marcadores no fueron uniformemente expresados, se encontraron en subgrupos de células, indicando que la población de células madre de pulpa dentaria es heterogénea. La morfología de las células que expresaron STRO-1 y CD146 "positivo" varió entre fusiforme, fusiformes con citoplasma ancho y formas no definidas. La presencia de células marcadas con STRO-1+, CD146+ y CD45-, confirma la existencia de células madre o progenitoras en las poblaciones de células de la pulpa dentaria humana aisladas. (Tabla 1). También, se llevaron a cabo las pruebas inmunohistoquímicas en cortes histológicos de una muestra de pulpa dentaria humana, se observó marcaje en la zona perivascular con el STRO-1+ y CD146/MUC18+, mientras que no se observó marcaje con el anticuerpo anti- CD45, el cual fue negativo.

3. DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE FORMACIÓN DE COLONIAS DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

En los cultivos en monocapa de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas, las células fueron capaces de formar colonias a baja densidad. Las colonias estaban formadas por numerosas células adherentes, la morfología de las células típica de fibroblastos, fusiformes, alargadas, con un citoplasma claro y un núcleo ovalado central con varios nucléolos, que identifica la CFU-F. Demostrando su capacidad de renovación y eficiencia de formación de colonias. Sin embargo, la eficiencia de formación de colonias expresada en porcentaje, varió entre las diferentes líneas celulares. Las líneas celulares sembradas a una densidad de 100 células por placa de 35 mm (8,8 cm2) formaron colonias ? 50 células, al calcular la eficiencia de formación de colonias se obtuvieron los siguientes resultados 18,3%, 15,6%, 42% de células capaces de formar colonias, además de los agregados de 10 a 40 células.


DISCUSIÓN

El objetivo general del presente trabajo de investigación es establecer el cultivo de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana. Sin embargo, la inducción a la diferenciación hacia diferentes linajes será publicado posteriormente, para cumplir con los criterios mínimos, para identificar a las células madre en la población de células aisladas. El primer obstáculo para el establecimiento exitoso del cultivo de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana fue la desinfección de los dientes para prevenir la contaminación. El protocolo para la desinfección utilizado, como se describió en materiales y método incluía el lavado con PBS y la desinfección con alcohol al 70% ^18-21. Sin embargo, Perry y col.³¹ recomiendan un protocolo adaptado del banco de cornea, para remover las bacterias y de esta manera no perder los cultivos por contaminación bacteriana. Sería recomendable realizar un estudio comparativo entre ambos protocolos, para determinar la efectividad de cada uno de ellos. Se seleccionaron terceros molares retenidos por ser un tejido descartable ²². El germen de los terceros molares comienza su desarrollo alrededor de los 6 años de edad. Hasta ese momento, el tejido embrionario de la lámina dentaria permanece inactivo e indiferenciado en los maxilares del niño. Aunque, la mineralización de la corona comienza durante los 8 años de edad, frecuentemente sus raíces están incompletamente formadas a la edad de 18 años. Esto significa que la estructura de estos dientes es inmadura a esta edad y una población de células indiferenciadas reside en la zona rica en células de la pulpa del germen dentario, necesarias para el desarrollo completo del diente ³². Por lo que los terceros molares pueden representar un origen valioso de células madre de pulpa dentaria humana. Para la obtención del tejido pulpar el calentamiento de los dientes mientras se cortan puede producir daño al tejido pulpar²⁵. Suchánek y col.³³ señalan que ellos no lograron aislar células madre de la pulpa dentaria, de dientes donde se separó la corona cortando en capas finas, sin enfriamiento, los autores suponen que la pulpa dentaria sufrió recalentamiento y un severo estrés mecánico, además lo consideran un método con un alto riesgo de contaminación. Mientras que si fueron capaces de aislar las células utilizando un fórceps Luer´s para fracturar las raíces y extraer la pulpa a través del conducto radicular o si la raíz no estaban completamente desarrolladas el foramen era ampliado y se extirpa la pulpa con una aguja por apical. En el presente trabajo para mantener la viabilidad de las células durante el corte de los dientes, se conservaron a baja temperatura y condiciones de humedad constante25 y en los casos de dientes con solo un tercio radicular formado, el tejido pulpar fue retirado por la raíz con zondas barbadas y colocado de inmediato en medio fresco, DMEM - F12 frío. Para el aislamiento de las células mesenquimales de la pulpa dentaria, la mayoría de los investigadores^{18,19,21,26,29,34-48} utilizan el método de disgregación enzimática, descrito por Gronthos y col.¹⁴. Igualmente, en el presente estudio se seleccionó este método, porque se consigue un gran número de células aisladas en corto tiempo y más representativo del tejido, que con las técnicas por explantes35,47 Para el cultivo de las células madre mesenquimales de pulpa dentaria la mayoría de los investigadores^{18,19,21,22,26,75,29,48-52} utilizan el medio ?-MEM propuesto por Gronthos y col.¹⁴ y también es ampliamente utilizado el medio DMEM,^39,45,53-56, con el que, igualmente, se obtiene un óptimo crecimiento celular. Sin embargo en el presente estudio se utilizó el medio DMEM-F12 que también proporciona buenos resultados⁴¹ y se ha utilizado en el laboratorio, en el protocolo para el cultivo de otros tipos de células 57. En la presente investigación las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, de terceros molares, mostraron un óptimo crecimiento, cultivadas en medio DMEM-F12, suplementado con 15 % de SFB, 100 μM L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina y 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B (antibiótico-antimicótico), condiciones de cultivo descritas previamente como óptimas.

Las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas, mostraron la morfológica típica de fibroblastos, células fusiformes con finas extensiones citoplasmáticas, lo que coincide con numerosas investigaciones ^{14,19,20,36,58} y es análoga a la progenie de la médula ósea humana ¹⁴. La cual se mantuvo durante los sucesivos pasajes. Sin embargo, en 3 de 4 líneas celulares que se sometieron a más de 6 subcultivos, además de la gran proliferación celular se observó la presencia de algunos agregados celulares en el sexto, séptimo y octavo subcultivo.

Las células cercanas al agregado mostraron algunos cambios morfológicos sugerentes a una posible diferenciación espontánea. Mientras que en el resto del cultivo las células conservaban su morfología fusiforme semejante a fibroblastos. La diferenciación espontánea de las células madre de pulpa dentaria sin añadir un medio inductor fue descrita por Alliot-Licht y col.⁵⁹, los autores refieren que la transformación espontanea del fenotipo celular puede ocurrir durante el cultivo. El proceso de mineralización ocurrió en ausencia de dexametasona y ?-GP. Los nódulos mineralizados fueron observados en cultivos primarios con largo tiempo de cultivo y en subcultivos del quinto pasaje. También, Tsukamoto⁴⁶ observó que las células de la pulpa de dientes temporales humanos, formaron nódulos mineralizados cuando crecieron en medio de cultivo en ausencia de medios inductores. La matriz formada en estos nódulos se tiñó fuertemente con von Kossa. Alrededor y entre estos nódulos las células fibroblásticas formaron una monocapa regular. Los autores observaron que la formación de nódulos mineralizados depende de la capacidad de las células para formar multicapas, in vitro. La ausencia del contacto inhibitorio parece esencial para proveer la estructura tridimensional que es necesaria para obtener un tejido mineralizado.

Para el análisis de la expresión de antígenos de superficie de las células mesenquimales de pulpa dentaria humana, a través de técnicas inmunocitoquímicas, para demostrar la presencia de células madre mesenquimales en la población de células aislada, se seleccionaron los anticuerpos anti- STRO-1, anti-CD146 y anti-CD45. Los resultados mostraron que las células aisladas de pulpa dentaria, del tercer pasaje expresaron moléculas de superficie celular STRO-1 y CD146 "positivos", también presentes en estudios previos en células madre mesenquimales de médula ósea ⁶⁰ y en células madre de pulpa dentaria humana de dientes permanentes ^14,21,61 y en dientes temporales exfoliados ³⁶ mientras, el marcador específico para células hematopoyéticas, el CD45, que reconoce el antígeno común de leucocito, monocitos y subgrupos de células T, fue "negativo". La ausencia de expresión de este marcador, indica que en las células aisladas de la pulpa, no están presentes progenitoras hematopoyéticas ³⁶ y coincide con los resultados de otras investigaciones^14,18,21,38. En particular, el STRO-1 es extremadamente importante en la selección de las células madre de la pulpa dentaria, solo las células STRO-1+ son capaces de diferenciarse en células semejantes a odontoblastos, lo que indica la importación de estas células en el proceso de reparación ³⁹. Las células madre contenidas en los cultivos de células de la pulpa dentaria expresan CD146, marcador de células de músculo liso, células endoteliales y pericitos, lo que indica que estas células pueden ser originadas de un microambiente perivascular ³⁶. Los autores ⁶² observaron que ambos anticuerpos el anti-STRO-1 y el anti-CD146 marcaban las mismas poblaciones celulares precursoras. En los cortes histológicos de la muestra de tejido pulpar las células localizadas alrededor de los vasos sanguíneos de la pulpa dentaria fueron positivas al STRO-1 y al CD146 (MUC18), por técnica inmunohistoquímica, confirmando las observaciones que señalan que las células madre de la pulpa dentaria pueden ser originadas de un microambiente perivascular ^36,63.

En la determinación de la eficiencia de formación de colonias de las células mesenquimales de pulpa dentaria humana se observó que al sembrar 100 células por placa se formaron numerosas colonias. Se evidenció una estrecha relación entre el número de células cultivadas y el número de colonias fibroblásticas que se desarrollaron, esto coincide con las observaciones realizadas por Friedenteins ²⁹ en el cultivo de células mesenquimales de médula ósea. La formación de colonias ocurre solo cuando la siembra se desarrolla a una cierta densidad inicial óptima de células, en caso de excesivo número de células por unidad de superficie los fibroblastos forman una monocapa, mientras en caso de insuficiente densidad ellas fallan en crecer. Establecer la EFC-F resulta en una correlación lineal entre el número de colonias y el número de células sembradas ⁶⁴.

En el presente estudio, en las poblaciones de células aisladas se identificaron células con características de células madre mesenquimales, como su capacidad de adherirse a las placas de cultivo, formar colonias altamente proliferativas, su morfología fusiforme y la expresión consistente de marcadores de superficie que caracteriza células madre mesenquimales adultas de pulpa dentaria. Sin embargo, faltaría determinar su capacidad de diferenciación para cumplir con los criterios básicos para definirlas como células madre.