EVALUACIÓN DEL COMPORTAMIENTO BIOLÓGICO DE TRES CEMENTOS
RESUMEN
El objetivo de este estudio fue evaluar el comportamiento biológico de los cementos endodónticos Endofill, Endomethasone y Sealer 26, en tejido conjuntivo subcutáneo de ratones. Fueron establecidos tres grupos experimentales y un grupo control de cinco animales cada uno, en los períodos de 7, 21 y 60 días. Los cortes histológicos obtenidos fueron coloreados con Hematoxilina & Eosina y con tricrómico de Masson, para posteriormente ser evaluadas la reacción inflamatoria adyacente y la formación de tejido fibroso. Los datos obtenidos fueron sometidos al test estadístico de Kruskall-Wallis y Miller con 5% de nivel de significancia. El análisis microscópico mostró reacción inflamatoria más intensa en los períodos de 7 y 21días. A los 60 días hubo formación de una cápsula fibrosa densa para el cemento Endomethasone y parcialmente densa para los demás cementos. El análisis estadístico mostró diferencia estadísticamente significativa con mayor intensidad de reacción inflamatoria solamente para el grupo II (Endofill) en el período de 60 días en relación a los grupos I (control) y grupo III (Endomethasone). Todos los materiales presentaron reacción inflamatoria más intensa en los períodos inicial e intermediario, siendo que la Endomethasone presentó los mejores resultados.
Palabras claves: Obturación del conducto radicular, biocompatibilidad, cementos endodónticos.
Biocompatibility of endodontic sealers
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the biological behavior of the root canal filling sealers: Endofill, Endomethasone and Sealer 26 when in contact with the subcutaneous connective tissue of rat. For the study one control and three experimental groups were used. A total of 15 animals were divided into 5 for each period: 7, 21, and 60 days. The obtained histological sections were processed and stained using the hematoxiline & eosine technique. The histological sections were subjective and comparatively analyzed using optic microscopy. The intensity of the inflammatory reaction and the level of fibrosis of the tissue were registered. The results were registered in scores and statistical analysis by KRUSKAL-WALLIS p<0,05 and MILLER methods. The statistical analysis revealed that in the period of 60 days, there was statistical significance to group II (Endofill) between group (control) and III (Endomethasone) with mononuclear cells into connective tissue. All materials promoted inflammatory reaction more intense at 7 and 21 days with the Endomethasone showing the best results.
El éxito del tratamiento endodóntico depende del correcto diagnóstico, de la limpieza y desinfección efectiva del sistema de conductos radiculares y de una adecuada obturación 1, complementando las etapas previas, cumpliendo así con los objetivos de la endodoncia 2.
La búsqueda de un cemento endodóntico que cumpla con todos los requisitos necesarios ha sido intensa, sin embargo, el material ideal que asocie buenas propiedades físicas y químicas con un comportamiento biológico adecuado aún merece atención 2-6. La reparación periapical que ocurre después del tratamiento endodóntico es influenciada, entre otros factores, por la composición de los diferentes cementos endodónticos 7. Sustancias incorporadas a los cementos obturadores con el propósito de promover una acción antimicrobiana pueden influenciar en la biocompatibilidad del material 6.
Existen varios tipos de materiales endodónticos propuestos para la obturación de conductos radiculares, como por ejemplo, los cementos a base de óxido de zinc y eugenol (OZE), ionómero de vidrio, silicona, resinas e hidróxido de calcio 8-12, más recientemente algunas sugerencias han sido hechas para el uso de MTA (Mineral Trióxido Agregado) 5. La incorporación de corticoides y otros elementos como el Trioximetileno a la fórmula básica de cementos a base de OZE dio origen al cemento Endomethasone, material que presenta resultados histológicos muy contradictorios.
Una característica importante que debe poseer un cemento endodóntico es la biocompatibilidad, pudiendo estimular el proceso de reparación de los tejidos periapicales o por lo contrario, si posee propiedades adversas, perjudicar este proceso contribuyendo al fracaso del tratamiento 4,9,13,14. Varios modelos experimentales son utilizados para la evaluación del comportamiento biológico de los cementos obturadores de conductos radiculares, tales como cultivo de células 15 y tejidos 16, análisis de reacción en tejidos duros y blandos, en animales experimentales y en humanos, así como estudios histoquímicos para observar el comportamiento de células frente a los materiales, antes y después de su endurecimiento 4. Actualmente son frecuentes los estudios in vitro de citotoxicidad 17, así como la colocación de implantes en tejido subcutáneo 6,12,18-20 y en hueso 21 de ratones.
El Endofill es un cemento endodóntico a base de óxido de zinc y eugenol (OZE) ampliamente utilizado en la clínica endodóntica. El Endomethasone también es un cemento endodóntico a base de OZE, que puede ser clasificado dentro de los cementos "momificadores" por la presencia de paraformoaldehido en su composición, además de la presencia de los corticosteroides que tienen por finalidad disminuir la reacción inflamatoria post-operatoria 22, siendo ampliamente estudiado en lo que se refiere a su biocompatibilidad 14,19,23-26. Ha sido observada una buena tolerancia clínica de este material y un porcentaje de éxitos que coincide con los valores normales obtenidos con otros materiales obturadores 5,22,27. Casos clínicos han reportado la ausencia de dolor en 95% de los dientes obturados con Endomethasone en casos de biopulpectomia y necropulpectomia, con un alto índice de éxito mismo habiendo extrusión del material 22. Histológicamente se demostró que este cemento tiene baja reacción inflamatoria y que fue menor que los cementos Rickert y AH26 5, observándose también la baja toxicidad del material después de una o dos semanas 23.
El cemento endodóntico Sealer 26 surgió a partir de la modificación del AH-26, un cemento a base de resina, en que fue substituida la plata de la fórmula original por hidróxido de calcio (37%) con el objetivo de disminuir la irritación provocada a los tejidos periapicales 27,28. Barbosa et al. 29 comprobaron la más baja citotoxicidad de este cemento cuando fue comparado con los cementos FillCanal, N Ricket y la pasta FS.
El objetivo de este estudio fue evaluar la reacción histológica provocada por tres diferentes cementos endodónticos: Endofill, Endomethasone y Sealer 26 en tejido subcutáneo de ratones.
MATERIAL Y MÉTODO
En este estudio fueron utilizados 15 ratones Wistar (Rattus norvegicus albinus), con un peso entre 250g y 350g, provenientes del Bioterio de la Universidad Federal del Paraná. Los materiales utilizados, su composición y respectivos fabricantes son mostrados en la tabla 1.
Los cementos fueron manipulados de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes e introducidos en tubos de polietileno esterilizados (P250, CPL medical´s, São Paulo, Brasil) de 10mm de longitud por 1.5mm de diámetro.
Fueron establecidos un grupo control y tres grupos experimentales (n=5), divididos de la siguiente manera, de acuerdo con el cemento endodóntico obturador evaluado: Grupo I, control (tubo vacio); Grupo II, Endofill; Grupo III, Endomethasone; Grupo IV, Sealer 26.
Los animales fueron anestesiados, por vía parenteral, con pentanembutal en dosis de 1 ml/Kg. La región dorsal de los animales fue depilada, la antisepsia fue realizada con Povidona Yodada (PVPI) y posteriormente fueron realizadas cuatro pequeñas incisiones con una lámina de bisturí nº11, siendo dos posteriores (pélvicas) e dos anteriores (escapulares). Después de la divulsión de los tejidos en una profundidad de aproximadamente 20mm, los tubos de polietileno conteniendo los tres cementos obturadores de conductos radiculares más un tubo vacío (control), fueron introducidos en el tejido subcutáneo tomando cuidado para no producir extrusión de los materiales, inmediatamente después, fue realizada la sutura.
Transcurridos los períodos experimentales de 7,21 y 60 días los animales, en grupos de cinco, fueron anestesiados y la región dorsal fue depilada, los tubos fueron removidos juntamente con la piel y el tejido subcutáneo alrededor de ellos. Después de la fijación en solución de BOUIN, constituida de 750mL de solución acuosa saturada de ácido pícrico, 250mL de formaldehido y 50mL de ácido acético glacial, las muestras fueron incluidas en bloques de parafina para la realización de la microtomía en cortes de 6µm de espesura, coloreados con Hematoxilina & Eosina (HE) y Tricrómico de Masson.
La intensidad de la reacción inflamatoria fue evaluada de acuerdo con las recomendaciones del "Council on Dental Materials and Devices", de la Asociación Dental Americana, por medio del establecimiento de scores, de la siguiente manera: nula o no significativa (0), discreta (1), moderada (2) e intensa (3). Este análisis fue realizado llevándose en cuenta la ausencia o presencia de neutrófilos, macrófagos, linfocitos, plasmocitos, células gigantes, cápsula fibrosa, áreas de necrosis y reabsorción, además de la formación de tejido óseo.
Los datos obtenidos fueron sometidos al análisis estadístico, siendo utilizados los métodos no-paramétricos de KRUSKAL-WALLIS y MILLER con 5% de significancia.
RESULTADOS
Inicialmente, todos los materiales evaluados presentaron reacción inflamatoria más intensa que disminuyó en forma gradual a lo largo de los períodos experimentales, siendo que el Endomethasone provocó una mejor reparación a los 60 días. La intensidad de la reacción inflamatoria a los diferentes cementos obturadores se muestra en la tabla 2.
Grupo I - control
A los 7 días, el cuadro histológico fue característico de inflamación crónica discreta, con la presencia de linfocitos, plasmocitos y macrófagos. Pocos neutrófilos polimorfonucleares fueron observados. El tejido presentaba vasos sanguíneos nuevos formados, los cuales se encontraban congestionados y dilatados. En algunos especímenes hubo tendencia a la invaginación del tejido dentro de la luz del tubo de polietileno. Más alejado de la luz del tubo se observó un tejido conjuntivo más organizado con predominio de fibras colágenas y fibroblastos. A los 21 días, el cuadro histológico fue aún de inflamación crónica discreta, mientras tanto el tejido conjuntivo ya se mostró más organizado. El cuadro estuvo caracterizado por menos linfocitos y plasmocitos y más fibroblastos y fibrocitos, definiendo un tejido nuevo formado y organizado. Hubo actividad angioblástica (formación de vasos) en torno de la luz del tubo con vasos congestionados. A los 60 días, fueron observadas pocas células inflamatorias mononucleares y el tejido alrededor de la abertura del tubo mostró características de cápsula fibrosa (fig.1A). El tejido conjuntivo se presentó más denso con fibrocitos y mayor concentración de fibras colágenas. Además, el grado de fibrosis fue moderado, con tendencia a la invaginación de tejido dentro de la luz del tubo.
Grupo II - Endofill
A los 7 días, la reacción inflamatoria crónica se mostró de magnitud discreta a moderada. El tejido conjuntivo junto al cemento presentaba proliferación fibroangioblástica y eventualmente eritrocitos extravasados y leucocitos polimorfonucleares. Más alejado de la abertura tubular, el tejido conjuntivo se presentó más organizado con predominancia de fibroblastos.
A los 21 días, la inflamación crónica fue de magnitud discreta, mostrando linfocitos, plasmocitos, células gigantes y macrófagos con partículas de cemento extravasado. Había intensa actividad angiofibroblástica y eritrocitos extravasados. El grado de fibrosis de la cápsula alrededor de la abertura tubular aún fue discreto. A los 60 días, las células inflamatorias mononucleares eran dispersas, predominando tejido conjuntivo nuevo formado en proceso activo de organización. El grado de fibrosis de la cápsula en torno de la abertura tubular fue más intenso, con predominio de fibroblastos y fibrocitos, pero el tejido aún se presentaba en fase de organización (fig. 1B).
Grupo III - Endomethasone
A los 7 días, el tejido conjuntivo junto a la abertura del tubo mostró pequeña extrusión de cemento, en contacto con estructuras compatibles con necrosis de tejido, edema e infiltrado inflamatorio crónico. Fueron observadas fibras colágenas dispersas. A los 21 días, había pocas células mononucleares y muchos fibroblastos seguidos de fibrocitos. El tejido conjuntivo nuevo formado se presentaba bien organizado, sin embargo con algunos vasos sanguíneos congestionados e dilatados. Fue observada una cápsula fibrosa en formación, presentando tejido conjuntivo moderadamente denso. A los 60 días, el tejido conjuntivo subcutáneo se mostró denso con pocos fibrocitos. La fig.1C muestra las fibras colágenas del tejido conjuntivo denso, mostrando cápsula fibrosa densa.
FIGURA 1
Fotomicrografía de la reacción inflamatoria del tejido subcutáneo en el período de 60 días. HE, 400X. A-Cápsula fibrosa rica en fibrocitos (Control), B-Tejido en fase de organización con células inflamatorias mononucleares (Endofill), C-Cápsula fibrosa densa (Endomethasone), D-Cápsula fibrosa y algunas células mononucleares Sealer 26. Grupo IV - Sealer26
A los 7 días, fue observado un infiltrado inflamatorio crónico de intensidad discreta a moderada, con predominio de células mononucleares, envolviendo una extensa área próxima a la abertura tubular. En algunas láminas fueron observadas células gigantes y macrófagos con residuos de material obturador fagocitado y algunos leucocitos polimorfonucleares. A los 21 días, la intensidad de la reacción inflamatoria era discreta, caracterizada por células mononucleares junto a la abertura del tubo de polietileno y ya había intensa actividad fibroblástica. En algunas láminas, fueron observadas células gigantes y macrófagos con residuos de material y algunos vasos congestionados. A los 60 días, aún fueron observados aglomerados de células inflamatorias mononucleares junto a la abertura del tubo y, luego abajo, había tejido conjuntivo organizado de aspecto denso. Pequeña banda de tejido conjuntivo elástico fue observada junto a la abertura del tubo y luego abajo el tejido conjuntivo denso, con pocas células (fig.1D).
Las tablas 3, 4 y 5 presentan el resultado del análisis estadístico por el método de Kruskal-Wallis (p<0.05%), de los grupos a los 7, 21 y 60 días. A los 7 días hubo diferencia estadísticamente significativa para los grupos II (Endofill) y IV (Sealer). A los 21 días no hubo diferencia estadística entre los grupos. A los 60 días hubo diferencia estadísticamente significativa. El test de Miller para la comparación entre los grupos mostró significancia estadística en el grupo II (Endofill) con peores resultados en relación a los grupos I (Control) y III (Endomethasone).
TABLA I
COMPOSICIÓN Y PROCEDENCIA DE LOS CEMENTOS OBTURADORES DE CONDUCTOS RADICULARES EVALUADOS. TABLA II
INTENSIDAD DE LA REACCIÓN INFLAMATORIA POR PERÍODOS DE ESTUDIO. TABLA III
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL TEST KRUSKAL-WALLIS, DE LA INTENSIDAD DE LA REACCIÓN INFLAMATORIA EN EL PERÍODO DE 7 DIAS. TABLA IV
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL TEST KRUSKAL-WALLIS, DE LA INTENSIDAD DE LA REACCIÓN INFLAMATORIA EN EL PERÍODO DE 21 DIAS. TABLA V
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL TEST KRUSKAL-WALLIS, DE LA INTENSIDAD DE LA REACCIÓN INFLAMATORIA EN EL PERÍODO DE 60 DIAS. DISCUSIÓN
La utilización de ratones en investigaciones biológicas está basada en la fácil manipulación, con ciclos de vida relativamente cortos, conocida anatomía, fisiología y variaciones genéticas 6,20. Este estudio mostró que todos los cementos endodónticos analizados mostraron algún efecto irritante sobre el tejido subcutáneo de ratones, lo que parece estar relacionado con la composición de cada material y del período experimental, siendo concordante con otras investigaciones similares en la literatura 3,4,6,12,18,20.
En este estudio fueron analizadas las reacciones de tres cementos endodónticos: Endofill, Endomethasone y Sealer 26, que fueron escogidos con base en estudios ya realizados, donde no fueron encontrados resultados definitivos 27. La pobre biocompatibilidad de los cementos a base de OZE es ampliamente conocida 3,28,29. Leonardo et al. 30, analizando la respuesta en tejidos provocada por el cemento FillCanal, de composición similar al Endofill, después de la obturación del conducto radicular en dientes de perros, observó que este material provoca una reacción inflamatoria de moderada a intensa después de un período de 90 días. En 1988, Leal et al. 3 utilizaron 15 ratones divididos en tres grupos experimentales, de acuerdo con los períodos de observación de 7,21 y 60 días. El FillCanal fue el cemento más irritante en ese estudio, concordando con los resultados de este trabajo. Veloso et al. 6 afirmaron que la biocompatibilidad de estos cementos es perjudicada por la presencia de eugenol, con sus propiedades citotóxicas.
Otros estudios revelaron que el comportamiento biológico inadecuado de los cementos a base de óxido de zinc y eugenol está relacionado con la liberación tardía y prolongada de eugenol 7,31 y de iones de zinc 32 que pueden participar en el desarrollo de la inflamación periapical o ser responsables por la persistencia de una lesión periapical pre-existente 14. En este estudio, el Endofill promovió el mayor grado de irritación, de intensidad moderada a intensa. Estos resultados están de acuerdo con el estudio de Batista et al. 26 que también evaluaron la reacción en tejidos provocada por este cemento obturador en tejido subcutáneo de ratones. Por otro lado, Queiroz et al. 15, en estudio empleando cultivo de macrófagos peritoneales, encontraron mejores resultados de citotoxicidad para el Endofill comparado con el Sealer 26, en lo que se refiere a la inducción de producción de óxido nítrico.
Entre los tres cementos estudiados, el Endomethasone presentó el mejor comportamiento biológico en los períodos experimentales iniciales, concordando con otros estudios que también relatan la baja citotoxicidad de este material 23. Ya el cemento Sealer 26 indujo una reacción inflamatoria moderada inicialmente que decreció después de 60 días. Este estudio mostró que la inflamación causada en el tejido subcutáneo de ratones por el Endomethasone disminuyó con el tiempo, lo que está de acuerdo con Kaplan et al. 7 y Zafalon et al. 19, probablemente por la neutralización del eugenol liberado inicialmente 33,34 y por la liberación local de corticoides, tales como, dexametasona e hidrocortisona 7,22. El paraformaldehido, que es uno de los componentes del Endomethasone, causa reacción alérgica y necrosis del tejido subcutáneo 7,35, sin embargo, esta reacción depende de la concentración de este producto liberado 36. Cabe destacar que la presencia de los paraformaldehidos en su composición torna este material contraindicado por muchos autores. Se verificó que en subcutáneo de ratones, a los 60 días el Endomethasone formó una densa cápsula fibrosa estructuralmente mejor que el Sealer 26,5.
El cemento Sealer 26 provocó una reacción inflamatoria moderada inicialmente que disminuyó en los períodos experimentales más largos, coincidiendo con Figueiredo et al. 28, quienes relataron que, en contacto con el tejido subcutáneo de ratones, el Sealer 26 indujo una reacción inflamatoria discreta en períodos experimentales más largos, 30 a 90 días. Batista et al. 26 también demostraron que la reacción inflamatoria inicial (7 días) causada por el Sealer 26 decrece después de 30 días.
El Sealer 26 surgió a partir del cemento AH 26, en que fue substituida la plata de la fórmula inicial por la adición de hidróxido de calcio 28, en la tentativa de obtener mejores propiedades biológicas 12. Existen varios estudios que relatan la irritación a los tejidos 32, la citotoxicidad 23 y el potencial mutagénico 37 del AH 26. Esta irritación es más intensa en los períodos iniciales en razón de la presencia del amino, de la resina epóxica bisfenol (Tetramino hexametileno) 15 y del óxido de titanio 38 en su composición. De acuerdo con Figueiredo et al. 28, la adición del hidróxido de calcio contribuyó para la disminución de la intensidad de la reacción inflamatoria provocada por los cementos a base de resina epóxica.
Algunos cementos a base de hidróxido de calcio poseen capacidad de auxiliar en la reparación y estimular la deposición de tejido mineralizado, además de la preservación de los tejidos periapicales, provocando menor reacción inflamatoria cuando están en contacto 4,18. Muchos estudios vienen siendo realizados para la evaluación de estos cementos 6,12,18, analizando las reacciones en tejidos subcutáneos de ratones para el uso de estos materiales. Valera et al. 12 evaluaron la biocompatibilidad de tres cementos a base de hidróxido de calcio, entre ellos el Sealer 26 y un cemento a base de ionómero de vidrio (Ketac Endo); mostrando que todos los cementos presentaron, después de 90 días, una reducción de la reacción inflamatoria, formación de cápsula fibrosa en contacto con la abertura del tubo que contenía el material de relleno y reducción de la proliferación fibroblástica. La menor respuesta inflamatoria fue encontrada en el grupo del Sealer 26. En contraposición, Veloso et al. 6 evaluaron histológicamente el comportamiento de tejidos subcutáneos de 60 ratones después de los implantes de tubo de polietileno rellenos con Sealapex, Apexit y Sealer 26, concluyendo que el cemento Sealapex fue más biocompatible, coincidiendo con los hallados de Nassri et al. 18 que concluyeron que el Sealapex presentó menor agresividad, obteniendo mejores resultados en relación al Apexit. Comparando el Sealer 26 con el cemento Endofill, Queiroz et al. 15 en el 2005, hallaron que el Sealer 26 causó significativamente mayor toxicidad a los macrófagos, posiblemente debido a sus componentes como la resina epóxica.
CONCLUSIONES
Todos los cementos analizados se mostraron irritantes al tejido subcutáneo de ratones.
La reacción inflamatoria en el tejido subcutáneo fue más intensa en los períodos de 7 y 21 días.
Hubo diferencia estadísticamente significativa, en la intensidad de la reacción inflamatoria, solamente en el grupo II (Endofill) en el período de 60 días en relación a los grupos I (control) y el grupo III (Endomethasone).
El cemento Endomethasone fue el menos irritante de todos los materiales evaluados, observándose una cápsula fibrosa en formación y a los 60 días fue observado un tejido conjuntivo denso con pocos fibrocitos.
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