Casos Clínicos

Detección e identificación de Candida Dubliniensis por métodos fenotípicos en Estomatitis Sub-protésica - Reporte de un caso

Recibido para Arbitraje 10/10/2011
Aceptado para Publicación:17/02/2.012

  • Germán Pardi C. Profesor Titular, Cátedra de Microbiología, Facultad de Odontología, UCV.

  • Sofía Mata Essayag. Profesora Titular (Jubilada) de la Cátedra de Microbiología, Escuela de Medicina "Luis Razetti". Jefe del Servicio de Micología Médica "Dr. Dante Borelli", Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, UCV.

  • María Teresa Colella. Lic. en Bioanálisis. Servicio de Micología Médica "Dr. Dante Borelli", Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, UCV.

  • Arantza Roselló. Lic. en Bioanálisis. Servicio de Micología Médica "Dr. Dante Borelli", Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, UCV.

  • Vanessa Pineda. Estudiante de Bioanálisis, UCV. Servicio de Micología Médica "Dr. Dante Borelli", Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, UCV.

  • Dayana Camacho. Lic. en Bioanálisis, UCV.
DETECCIÒN E IDENTIFICACIÒN DE Candida dubliniensis POR MÉTODOS FENOTÍPICOS EN ESTOMATITIS SUB-PROTÉSICA. REPORTE DE UN CASO

RESUMEN
La Estomatitis Sub-Protésica es una afección comúnmente observada en sujetos portadores de prótesis dentales removibles. Son numerosos los reportes publicados en los que se asocia esta patología con la presencia de hongos del Género Candida, y particularmente con Candida albicans. No obstante, algunas cepas identificadas como C. albicans, pudieran no tratarse en realidad de este microorganismo sino de Candida dubliniensis, más aún si se toma en cuenta que ambas especies producen clamidoconidias. Es por ello que resulta necesario comparar distintos métodos fenotípicos que permitan diferenciar en buena medida a ambas especies. En este artículo se describe el caso de una paciente portadora de prótesis removible superior con diagnóstico clínico de Estomatitis Sub-Protésica, a quien se le tomó muestras del paladar afectado y de la prótesis implicada. Se emplearon diferentes métodos fenotípicos de identificación diferencial de ambas especies, entre estos: CHROMagar Candida, Agar tabaco, Agar Pal´s, Agar Tween 80, medio de tomate y zanahoria y de Agar Sabouraud con NaCl al 6,5% (P/V). También se realizaron la pruebas de termotolerancia a 45ºC, aglutinación en latex, así como la identificación a través del sistema ID 32C (bioMerieux). Una vez empleados los métodos antes mencionados, la especie encontrada en el paladar de la paciente fue C. dubliniensis, en tanto que la que se halló en la prótesis fue C. albicans, siendo esta la primera vez que se detecta e identifica en nuestro país a C.dubliniensis en pacientes que presentan esta patología bucal.

Palabras claves: Candida dubliniensis, Estomatitis Sub-Protésica, Candida albicans, detección.


DETECTION AND IDENTIFICATION OF METHODS FOR PHENOTYPIC Candida dubliniensis IN DENTURE STOMATITIS. REPORT OF A CASE

ABSTRACT
Denture stomatitis is a condition commonly observed in subjects with removable dentures. There are numerous reports published in which this disease is associated with the presence of fungi of the genus Candida, particularly Candida albicans. However, some strains identified as C. albicans, may not actually be this organism but Candida dubliniensis, especially if one takes into account that both species produce clamidoconidias. That is why it is necessary to compare different phenotypic methods to differentiate largely to both species. This article describes the case of a patient with upper removable prosthesis with a clinical diagnosis of Denture Stomatitis, whom he took samples of the palate is affected and the prosthesis involved. Different methods were used phenotypic differential identification of both species, among them: CHROMagar Candida Agar snuff, Pal's Agar, Tween 80 Agar, tomato and carrot medium, and Sabouraud Agar with 6.5% NaCl (P / V ). Also thermotolerance tests performed at 45 ° C, latex agglutination, and identification by ID 32C system (bioMerieux) were used. Once employed the above methods, the species found in the mouth of the patient was C. dubliniensis, whereas that was found in the prosthesis was C. albicans, marking the first time it is detected and identified in our country C.dubliniensis in patients with this oral pathology.

Key words: Candida dubliniensis, Denture Stomatitis, Candida albicans, detection.


INTRODUCCIÓN

La Estomatitis Sub-Protésica es un término que hace referencia a cambios inflamatorios intrabucales, restringidos a la mucosa que cubre una prótesis dental, afectando principalmente a sujetos portadores de prótesis dental removible1-4. Esta entidad describe cambios patológicos encontrados en los tejidos de soporte de la prótesis dental5, los cuales se suscitan debido a una proliferación fibroepitelial provocada por la interacción de la mucosa con la base acrílica o metálica de la prótesis6. Clínicamente, esta entidad se caracteriza por la presencia de un eritema en los tejidos, siendo comúnmente encontrada en el maxilar superior y raramente en el inferior4,7. La mucosa se encuentra eritematosa, es de color rojo, brillante, eventualmente hemorrágica y puede presentarse además, con múltiples petequias localizadas en el paladar duro4,8,9.

Aún cuando se sabe que las evidencias sobre la etiología de la Estomatitis Sub-Protésica están inconclusas y son a menudo contradictorias, la mayoría de los autores coinciden en señalar que ésta es multifactorial4,10. Varios reportes publicados en la literatura indican que el tiempo de las dentaduras, su uso continuo, así como los hábitos de higiene influyen en el inicio y progresión de la Estomatitis Sub-Protésica11-13.

Diversos estudios han demostrado la presencia en altas proporciones de especies de Candida, principalmente Candida dubliniensis en pacientes con Estomatitis Sub-Protésica14-19. Otras especies que se han detectado e identificado han sido: Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis y Candida guillermondii16,20.

Por otra parte, en un estudio realizado por Mosca y colaboradores21, el cual se publicó en el año 2005, se confirmó el hallazgo de Candida dubliniensis tanto en paladar como en prótesis de una paciente adolescente con Estomatitis Sub-Protésica portadora de prótesis ortopédicas bucales.

C. dubliniensis es una de las especies emergentes que parecía estar asociada principalmente con la infección que se suscita en la cavidad bucal de pacientes infectados con el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)22,23, pero que ha sido aislada también en otras localizaciones anatómicas, de individuos sanos y en casos de infección sistémica22,24,25. Este microorganismo es un hongo dimorfo, cuya fase de levadura consiste en blastoconidias ovoides o esféricas con un tamaño que oscila entre 3-7µm x 3-14 µm. Las colonias que crecen en Agar Dextrosa Sabouraud (Oxoid) son redondas, convexas y de color crema, en tanto que las que crecen en Agar Dextrosa Papa son de color blanco-cremoso. En los medios de Agar-Arroz-Tween Agar (RAT Agar, bioMerieux) y Agar Harina de Maíz-Tween 80, esta especie produce pseudohifas (y pocas hifas verdaderas) con ramas cortas unilaterales, bilaterales o multiilaterales en los septos y produce abundantes clamidoconidias refráctiles con pared gruesa. Las clamidoconidias se pueden observar a menudo como tripletes o pares contiguos unidos en los extremos terminales de las pseudohifas ramificadas26.

La estrecha relación fenotípica y genotípica que existe entre C. dubliniensis y C. dubliniensis ha llevado a identificar incorrectamente la mayoría de los aislamientos de C. dubliniensis como C. dubliniensis, dificultando un análisis exhaustivo de esta especie22,27. En los últimos años se han desarrollado una serie de pruebas fenotípicas que han permitido la identificación rápida y viable de esta especie. Vale citar entre estas, el uso del medio de cultivo CHROMagar Candida, el medio de cultivo Staib Agar, los sistemas de identificación rápida de especies de levaduras como el API 20C AUX, ID 32, la prueba de termotolerancia, así como la prueba de aglutinación con latex28-35. Es por todo lo anteriormente expuesto que el objetivo de este artículo fue presentar el caso de un paciente portador de prótesis removible con Estomatitis Sub-Protésica, a quien se le identificó C. dubliniensis mediante el empleo de diferentes métodos fenotípicos.


REPORTE DEL CASO

Paciente femenino de 77 años de edad, VIH-, sin antecedentes de inmunosupresión, portadora de prótesis total removible superior de acrílico, la cual usa desde hace 25 años y quien acudió al Servicio de Clínica Estomatológica de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela para consulta odontológica, por presentar ligera molestia con sensación de ardor a nivel de la mucosa que recubre el paladar duro, además de sentirse la prótesis desajustada. Al examen clínico se pudo evidenciar que la mucosa del paladar se encontraba enrojecida y brillante, con signos evidentes de inflamación generalizada, razón por la cual el diagnóstico clínico fue Estomatitis Sub-Protésica Tipo II (según Newton). Cabe destacar que el área inflamada se encontraba demarcada por los bordes de la prótesis. Otro aspecto importante referido por la paciente fue que no se retiraba la prótesis al dormir. Dicha paciente fue referida al Servicio de Micología Médica del Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina de la UCV para tomarle muestras de placa asociada a dentadura, tanto de paladar como de prótesis (empleando para ello palillos de madera previamente esterilizados) y analizarlas, a fin de corroborar por una parte si la patología bucal estaba asociada a la presencia de Candida y por la otra, para detectar e identificar la o las especies implicadas tanto en el paladar afectado como en la prótesis.

Una vez que se tomaron ambas muestras se realizó en cada caso el examen directo con hidróxido de potasio (KOH) y tinta parker empleando el método lámina-laminilla, para corroborar la posible presencia de blastoconidias e hifas y se sembraron en el medio de cultivo Agar Sabouraud e incubaron en la estufa a 37ºC por 48-72 horas en condiciones de aerobiosis, a fin de evidenciar si crecían o no colonias de levaduras sugerentes de pertenecer al Género Candida. De igual forma las muestras tomadas de paladar y prótesis se sembraron en el medio bilis-agar Feo36 y se dejaron a temperatura ambiente por 72 horas a fin de evidenciar la posible presencia de clamidoconidias.

A partir de los crecimientos obtenidos en los medios antes mencionados, se procedió a detectar e identificar la (s) especies de Candida que pudieran encontrarse tanto en el paladar como en la prótesis de la paciente, empleando para ello los siguientes métodos fenotípicos:

  1. Medio CHROMagar Candida (CHROMagarMT Microbiology, Paris, France) a fin de observar de acuerdo al color de las colonias que crezcan en la superficie, de cual especie del Género Candida pudiera tratarse28,33,37. Las muestras se incubaron a 37°C durante 5 días. Al cabo de ese lapso se consignó el color desarrollado y el aspecto de la colonia.

  2. Medio de Agar Tabaco, para observar tanto el color de las colonias, como la apariencia macroscópica (aspecto liso o rugoso y presencia de borde regular o festoneado) y microscópica de las mismas. Se preparó de acuerdo con la técnica de Khan et al. empleando cigarrillos marca Malboro®. Las placas se sembraron en forma de círculo de 1 cm de diámetro y se incubaron a 30 °C durante 48-72 horas38.

  3. Medio de Agar Pal´s (Agar con semillas de girasol), incubando las muestras sembradas a 30ºC. por 48-72 horas, a fin de evidenciar tanto la morfología de las colonias que pudieran crecer en este medio como la presencia o no de una franja de hifas alrededor de estas)39.

  4. Medio Agar-Tween 80 al 1% para detectar la actividad lipolítica en medio de opacidad. Se sembró de igual forma que en el medio Agar Tabaco y se incubó a 30 °C durante 72 horas. Transcurrido este tiempo se observó a fin de verificar si había o no la presencia de un halo opaco alrededor de la colonia40.

  5. Medio de Tomate y Zanahoria a fin de evidenciar si se producían o no clamidoconidias. Se preparó un extracto con 20 g de zanahoria rallada y 20 g de tomate picado y sin semillas, se hirvieron durante 1 hora en 1 litro de agua, se filtró por gasa y se llevó nuevamente a volumen de 1 litro, se agregaron 20 g de agar, se disolvió y se autoclavó durante 15 min a 1 atm. de presión. Se vertió el medio sobre portaobjetos (3 ml) y se sembró por incisión, se colocó un cubreobjetos estéril y se incubó en cámara húmeda a 30 °C durante 48 horas41.

  6. Medio de Agar Sabouraud con NaCl al 6,5% (P/V) a fin de evidenciar el crecimiento que pueda manifestarse en ese medio32.

  7. Prueba de Termotolerancia en el medio de Sabouraud a 45ºC, con la finalidad de determinar si hay crecimiento microbiano o no a la temperatura antes mencionada al cabo de 48 horas42.

  8. Prueba de Aglutinación con látex para identificación rápida de C. dubliniensis (Bichtro-Dubli Fumouze, Fumouze Diagnostics, France), colocando una pequeña porción de una colonia sospechosa purificada en el dispositivo empleado para ese fin y que forma parte del sistema de identificación. Luego se colocó sobre la porción de colonia una o dos gotas del reactivo de látex, mezclándolas con una espátula plástica y se dejó esperar por 5 minutos a fin de corroborar si había o no alguna reacción34,43.

  9. Identificación con el sistema ID 32C (bio-Merieux, Francia), el cual se basa en el principio de asimilación de carbohidratos y que ha sido empleado por diversos autores16,44. Esta se realizó según las especificaciones de la casa fabricante.
Cabe destacar que como cepas control se emplearon: C. dubliniensis ATTC 99214 y C. dubliniensis NCPF 3949 (colección española)


RESULTADOS

Paladar
A partir de la muestra tomada del paladar de la paciente, se pudo evidenciar en primera instancia que al realizar el examen directo con KOH y tinta parker se observaron numerosas blastoconidias e hifas. También se evidenció el crecimiento en el medio Agar-Sabouraud de colonias blanco-cremosas, redondas, pequeñas, elevadas, algunas de estas con bordes lisos y otras con bordes irregulares, opacas y con olor a levadura, sugerentes de pertenecer al Género Candida, así como la presencia de hifas con abundantes clamidoconidias que crecieron en el medio bilis-agar Feo (Figura 1).

Figura 1
Presencia de hifas la presencia de hifas con abundantes clamidoconidias sugerentes de ser C. dubliniensis.

Los resultados de las distintas pruebas diferenciales referentes a los aspectos macro y microscópicos de las colonias y características bioquímicas con los distintos perfiles fenotípicos fueron los siguientes:

  1. Crecimiento de colonias de color verde oscuro en el medio CHROMagar Candida (Figura 2)

    Figura 2
    Colonias de Candida dubliniensis (color verde oscuro) que crecieron en el medio CHROMagar Candida.

  2. Crecimiento en el medio de Agar Tabaco de colonias de color amarillo-dorado, de aspecto seco y rugoso (Figura 3), las cuales al visualizarlas al microscopio de luz se observaron hifas con presencia de abundantes clamidoconidias.

    Figura 3
    Crecimiento de colonia de Candida dubliniensis en el medio Agar Tabaco. Nótese el color amarillo-dorado de la colonia, así como el aspecto rugoso de la misma.

  3. Crecimiento de colonias de color crema, rugosas, con abundantes clamidoconidias en el medio de Agar Pal´s.

  4. Ausencia de halo alrededor de las colonias que crecieron en el medio Agar Tween 80.

  5. Observación al microscopio de luz de hifas con clamidoconidias que crecieron en el medio Agar Tomate-Zanahoria.

  6. Ausencia de crecimiento a simple vista en el medio hipertónico de Agar Sabouraud con 6,5% de NaCl.

  7. Ausencia de crecimiento en Agar Sabouraud a 45ºC, luego de 48 horas de incubación.

  8. Reacción positiva a la prueba de aglutinación con látex, expresada mediante la formación de un halo oscuro periférico conteniendo la mezcla aglutinada, luego de pasados 5 minutos (Figura 4).

    Figura 4
    Reacción positiva (CP) de colonia de C. dubliniensis a la prueba de aglutinación con látex. Nótese la formación de un halo oscuro periférico conteniendo la mezcla aglutinada.
Todos los resultados de las pruebas fenotípicas realizadas expresados con anterioridad, conllevan a que la especie identificada en el paladar de la paciente con ESP sea C. dubliniensis.

Ahora bien, con el resultado de la prueba de identificación rápida de levaduras con el sistema ID 32C, se corroboró que la especie en cuestión era C. dubliniensis con un margen de seguridad de 99,5%. Cabe destacar que el número introducido al software, el cual expresa cuales pruebas de asimilación de azúcares dieron positivas y cuales dieron negativas fue: 5142-1000-15.

Las pruebas de asimilación de azúcares que dieron positivas fueron: D-Galactosa, D-Sacarosa, N-Acetil Glucosamina, D-Maltosa, 2-ceto Gluconato Potásico, D-Sorbitol, D-Manitol, D-Glucosa y Glucosamina, en tanto que las pruebas de asimilación de: Ciclohexamida (Actidiona), Ácido Láctico, L-Arabinosa, ,D-Celobiosa, D-Rafinosa, D-Trealosa, Metil-α-D-Glucopiranosida, D-Xilosa, D-Ribosa, Glicerol, L-Ramnosa, Palatinosa, Eritrol, D-Melobiosa, Glucuronato Sódico, D-Melecitosa, Gluconato Potásico, Ácido Levulínico, D-Lactosa, Inositol y D-Sorbosa dieron negativas luego de 48 horas de incubación. También hay que señalar que la prueba de hidrólisis de la Esculina dio positiva.

Prótesis
A partir de la muestra tomada de la prótesis de la paciente, se pudo evidenciar en primera instancia que al realizar el examen directo con KOH y tinta parker se observaron numerosas blastoconidias e hifas. También se evidenció el crecimiento en el medio Agar-Sabouraud de colonias blanco-cremosas, redondas, grandes, elevadas, con bordes lisos, brillantes y con olor a levadura, sugerentes de pertenecer al Género Candida, así como la presencia de hifas con clamidoconidias que crecieron en el medio bilis-agar Feo, aunque no en tanta cantidad como en la muestra proveniente del paladar.

Los resultados de las distintas pruebas diferenciales referentes a los aspectos macro y microscópicos de las colonias y características bioquímicas con los distintos perfiles fenotípicos fueron los siguientes:

  1. Crecimiento de colonias de color verde claro en el medio CHROMagar Candida

  2. Crecimiento en el medio de Agar Tabaco de colonias blancas y lisas, las cuales al visualizarlas al microscopio de luz no se observó la presencia de clamidoconidias.

  3. Crecimiento de colonias lisas, sin clamidoconidias en el medio de Agar Pal´s.

  4. Presencia de halo alrededor de las colonias que crecieron en el medio Agar Tween 80.

  5. Ausencia de clamidoconidias en el medio Agar Tomate-Zanahoria.

  6. Crecimiento a simple vista en el medio hipertónico de Agar Sabouraud con 6,5% de NaCl.

  7. Crecimiento de colonias en Agar Sabouraud a 45ºC, luego de 48 horas de incubación.

  8. Ausencia de aglutinación con látex luego de pasados 5 minutos, lo que es indicativo de reacción negativa.
Todos los resultados de las pruebas fenotípicas realizadas expresados con anterioridad, conllevan a que la especie identificada en el paladar de la paciente con ESP sea C. dubliniensis.

Ahora bien, con el resultado de la prueba de identificación rápida de levaduras con el sistema ID 32C, se corroboró que la especie en cuestión era C. dubliniensis con un margen de seguridad de 99,9%. Cabe destacar que el número introducido al software, el cual expresa cuales pruebas de asimilación de azúcares dieron positivas y cuales dieron negativas fue: 7347-3400-15.

Las pruebas de asimilación de azúcares que dieron positivas fueron: D-Galactosa, Ciclohexamida (Actidiona), D-Sacarosa, N-Acetil Glucosamina, Ácido Láctico, D-Maltosa, D-Trealosa, 2-ceto Gluconato Potásico, Metil-a-D-Glucopiranosida, D-Sorbitol, D-Xilosa, Palatinosa, D-Manitol, D-Glucosa y Glucosamina, en tanto que las pruebas de asimilación de: L-Arabinosa, D-Celobiosa, D-Rafinosa, D-Ribosa, Glicerol, L-Ramnosa, Eritrol, D-Melobiosa, Glucuronato Sódico, D- Melecitosa, Gluconato Potásico, Ácido Levulínico, D-Lactosa, Inositol y D-Sorbosa dieron negativas luego de 48 horas de incubación. También hay que señalar que la prueba de hidrólisis de la Esculina dio positiva.


DISCUSIÓN

La Estomatitis Sub-Protésica es la infección bucal más frecuente que se suscita en individuos portadores de prótesis dentales removibles y C. dubliniensis es el microorganismo mayormente implicado en esta patología3,18,45,46. Independientemente del tipo de Estomatitis Sub-Protésica, diversas especies de Candida, entre estas C. dubliniensis, pueden estar presentes en muchos casos. De igual forma, estos microorganismos se encuentran en mayores proporciones tanto en la mucosa de soporte como en las prótesis de los individuos con Estomatitis Sub-Protésica al compararlos con sujetos portadores de prótesis removibles sin esta afección47.

A pesar de la estrecha relación filogenética existente entre C. dubliniensis y C. dubliniensis, todavía es escasa la información disponible sobre la epidemiología y el significado clínico de estas especies. Los estudios epidemiológicos publicados señalan que C. dubliniensis está presente en la mucosa bucal de sujetos sanos en porcentajes menores al 10%, en tanto que su prevalencia puede incrementarse en pacientes que presentan alteraciones del sistema inmunológico, así como en presencia de patologías bucales. De igual forma, se han publicado estudios donde se destaca el papel de C. dubliniensis en enfermedades fúngicas sistémicas, por lo que resulta imprescindible su correcta identificación en el laboratorio de micología35.

Si bien es cierto que ya se había identificado a C. dubliniensis en pacientes con Estomatitis Sub-Protésica, de acuerdo a lo reportado por estudios previos realizados en Argentina21, Brasil47 y España48y que en Venezuela, también se había aislado a esta especie a partir de muestras provenientes de cavidad bucal de sujetos VIH+31,32, es la primera vez que en nuestro país se reporta a este hongo en el paladar de una paciente portadora de prótesis removible con la patología bucal antes mencionada.

La identificación de especies de Candida a través del medio CHROmagar Candida (CHROMagar, Paris, France) en lo que a nuestro caso se refiere, fue bastante útil, si se toma en consideración el crecimiento de colonias color verde oscuro a partir de las muestras provenientes de paladar, así como el crecimiento de colonias color verde claro a partir de las muestras provenientes de la prótesis, correspondientes a C. dubliniensis y C. dubliniensis respectivamente, más aún si tal como lo expresan diversas publicaciones35,38,49,50, el uso de este medio de cultivo es particularmente ventajoso para la distinción presuntiva entre ambas especies como aislamiento primario en cultivos mixtos a 37ºC. No obstante, las colonias de C. dubliniensis pueden perder su característico color verde oscuro cuando crecen en subcultivos a 37ºC, mientras que las colonias de C. dubliniensis pueden mantener el mismo color durante períodos prolongados de incubación35, además de que no siempre se evidencia la diferencia de color y basarse solamente en este aspecto, puede traer a confusión, tal y como lo expresan algunos autores51-53. Estos aspectos conllevan a sostener que el empleo del medio CHROmagar Candida no es suficiente como único método fenotípico para la identificación de C. dubliniensis54,55.

El crecimiento de colonias de color amarillo-dorado, de aspecto seco y rugoso en el medio de Agar Tabaco a partir de las muestras provenientes de paladar constituye un aspecto relevante en la identificación fenotípica de C. dubliniensis. De igual forma, el crecimiento de colonias blancas y lisas en este medio a partir de las muestras provenientes de prótesis fue determinante para la identificación fenotípica de C. dubliniensis. Este resultado coincide con el obtenido por Pineda y colaboradores (2008)29, quienes demostraron que todos los aislamientos de C. dubliniensis (212) en el medio de Agar-Tabaco presentaron colonias de aspecto rugoso y color dorado, en tanto que 195 cepas (98,0%) de C. dubliniensis fueron blancas y lisas.

Otro aspecto importante a considerar es el relacionado con la producción de clamidoconidias, cuestión esta que se evidenció en los medios de Agar Tabaco, Agar Tomate-Zanahoria y Agar Pal´s a partir de las muestras provenientes de paladar, lo que es indicativo de que la especie identificada fue C. dubliniensis, en contraste con la ausencia de clamidoconidias en los medios antes señalados a partir de las muestras provenientes de prótesis, tratándose en este caso de C. dubliniensis. Estos medios se han considerado que son muy buenos para la identificación de C. dubliniensis, así como para diferenciar a esta especie de C. dubliniensis, según lo expresado por varios autores31,39,41,56.

El crecimiento de colonias de levaduras en Agar Sabouraud a 45ºC a partir de las muestras provenientes de prótesis, así como la ausencia de crecimiento a esta temperatura en las muestras provenientes de paladar, permitió diferenciar también entre C. dubliniensis y C. dubliniensis, resultando tal y como lo señalan Pineda y col., (2008) un método satisfactorio de identificación, aún cuando hay que considerar la posibilidad de aparición de resultados tanto falso-positivos como falso-negativos57. De igual forma, la ausencia del halo de opacidad alrededor de las colonias que crecieron en el medio de Agar Tween 80, a partir de las muestras provenientes de paladar fue un indicativo en la identificación fenotípica de C. dubliniensis, en contraste con la presencia de dicho halo alrededor de las colonias que crecieron en el medio antes mencionado, a partir de las muestras provenientes de la prótesis, identificándose en este caso las colonias como C .dubliniensis. Señalan Pineda y col.,29 que la presencia del halo de opacidad se debe a la actividad de lipasa ejercida por las colonias de C. dubliniensis, en tanto que las colonias de C. dubliniensis que crecen en Agar Tween 80, no poseen esta actividad enzimática. Sostienen además que la formación de halo de precipitación en el medio de opacidad demostró muy buena sensibilidad y especificidad para C. dubliniensis, cuando se usa CaCl2 al 0,1%, ya que la visualización con una concentración menor es dificultosa. Sin embargo, este medio no es lo suficientemente confiable para realizar la diferenciación entre estas dos especies cuando se utiliza como único método fenotípico.

La reacción positiva a la prueba de aglutinación con látex, expresada mediante la formación de un halo oscuro periférico conteniendo la mezcla aglutinada, luego de pasados 5 minutos, fue otro aspecto a considerar de gran importancia en la identificación fenotípica de C. dubliniensis, más aún si tal y como lo señalan Sahand y col., (2006)43, este método desarrollado para detectar antígenos del hongo en referencia, muestran una sensibilidad superior a 97% y una especificidad de 100%.

El empleo del sistema ID 32C (bio-Merieux, France) también resultó de gran ayuda para la identificación de C. dubliniensis con un margen de seguridad excelente (99,5%), al igual que para la identificación de C. dubliniensis (99,9%). Si bien es cierto que existen experiencias anteriores en lo que a la identificación de especies de Candida en pacientes con Estomatitis Sub-Protésica se refiere16, en esa oportunidad se utilizó el sistema API 20C AUX (bio-Merieux, France), el cual a pesar de ser un sistema de identificación altamente confiable debido a la facilidad de su uso, así como por la rapidez y exactitud con la que pueden detectarse estos microorganismos, de acuerdo a lo expresado por diversos autores58-64, tiende a ser un sistema de identificación más limitado que el ID 32, ya que el sistema ID 32C posee una mayor variedad de sustratos a ser asimilados que el sistema API 20C AUX, cuestión esta que podría influir en una correcta identificación diferencial entre C. dubliniensis y C. dubliniensis. Algunos investigadores también señalan que análisis de los perfiles obtenidos tanto con el sistema API 20 C AUX como con el ID 32C, muestran con claridad la posibilidad de identificación diferencial entre C. dubliniensis y C. dubliniensis mediante el empleo de estos métodos comerciales29,57,65. Refieren además que las pruebas de asimilación de Xilosa y Metil- α-D-Glucopiranosida son claves en la diferenciación de las dos especies, ya que C. dubliniensis no asimila ninguno de estos dos carbohidratos, en tanto que C. dubliniensis si los asimila. En nuestro caso coincide el resultado con lo expresado por estos autores, ya que en el caso de las muestras provenientes de paladar, a partir de las cuales se detectó a C. dubliniensis, el perfil de identificación resultante con el sistema ID 32C reflejó que ni la Xilosa ni la Metil-a-D-Glucopiranosida fueron asimiladas, y en el en el caso de las muestras provenientes de próteis, a partir de las cuales se detectó a C. dubliniensis, el perfil de identificación resultante con el sistema ID 32C reflejó que los carbohidratos antes mencionados si fueron asimilados.

Por otra parte, destacan Jabra-Rizk y col.66, que C. dubliniensis tiene una capa externa de fibrillas reducida, lo que demuestra su capacidad para coagregarse con bacterias como Fusobacterium nucleatum a diferentes temperaturas de crecimiento (25ºC-37ºC). Refieren además que una reducción en su capa hidrofílica que resulta en una superficie celular hidrofóbica, puede darle a esta especie una mayor ventaja ecológica, permitiendo así una mayor fijación a los microorganismos y a las células epiteliales bucales. Esto pudiera explicar el por qué la especie detectada en el paladar fue C. dubliniensis y no C. dubliniensis.

No es de extrañar que la especie identificada en la prótesis de la paciente haya sido C. dubliniensis. De hecho, se han descrito distintos mecanismos a través de los cuales esta especie se puede adherir a la superficie de acrílico de las prótesis dentales, pudiendo citar los siguientes: a) A través de la producción de una capa adicional de fibrillas sobre la superficie de los tubos germinales, la cual es responsable del incremento de la adherencia de este microorganismo a las superficies plásticas67; b) por intermedio de la saliva completa estimulada que cubre la superficie de acrílico de las prótesis68; c) mediante glicoproteínas salivales del tipo mucinas, las cuales sirven de receptores a ciertas adhesinas del hongo69; y d) a través del Polímero Extracelular (PE) sintetizado por esta especie70. Es importante destacar que la adherencia por parte de Candida a la superficie de acrílico de las prótesis dentales, constituye tal y como lo han afirmado Ellepolla y Samaranayake71 en un reporte publicado en 1998, el primer paso en la patogénesis de la Estomatitis Sub-Protésica asociada a este hongo.

Se ha estudiado el efecto que tiene la saliva en la adherencia de C. dubliniensis sobre la superficie de acrílico de las prótesis dentales. En cuanto a este particular se refiere, hay autores como Elgezabal y col.,72 (2004), quienes refieren que la IgA y anticuerpos monoclonales de la saliva inhiben la capacidad de este microorganismo para adherirse a las prótesis. De igual forma, Moura y col.,73 (2006) señalan que la saliva completa estimulada disminuye la capacidad de adherencia de C. dubliniensis sobre el acrílico de las prótesis dentales, pero ello va a depender del sustrato que haya en el medio, así como de diferencias en la composición y viscosidad de la saliva. Estos aspectos antes descritos pudieran explicar el hecho de no haber encontrado C. dubliniensis en la prótesis de la paciente. Otra causa que pudiera explicar el por qué no se encontró C. dubliniensis en la prótesis de la paciente es como lo señalan Marsh y Martin74 (2009), producto de la resistencia a la colonización por parte de los microorganismos residentes que conforman la placa subprotésica.

Si bien es cierto que algunos de estos métodos fenotípicos (como el Agar Tabaco o el Agar Tomate Zanahoria), permiten la identificación diferencial entre C. dubliniensis y C. dubliniensis con bastante exactitud, coincidimos con Pineda y col.,29 quienes refieren que se necesitan comparar al menos 3 métodos fenotípicos para lograr una identificación más precisa de estos microorganismos.

Por otra parte, es conveniente señalar que aún cuando la identificación de C. dubliniensis y C. dubliniensis a través de diversos métodos fenotípicos constituye un parámetro útil a la hora de diferenciar a ambas especies, son realmente los métodos genotípicos como la Amplificación al azar del ADN Polimórfico de los aislamientos de Candida provenientes de pacientes con Estomatitis Sub Protésica (RAPD).o la Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE), entre otros, los que permiten la identificación definitiva de estos hongos.


CONCLUSIÓN

La detección e identificación de C. dubliniensis en el paladar de la paciente referida en este caso a través de diferentes métodos fenotípicos, constituye un hallazgo importante ya que por una parte, su presencia en boca no se limita solamente a aquellos sujetos VIH+/SIDA, y por la otra que esta especie al parecer pudiera encontrarse con una frecuencia mayor de lo que se pensaba en aquellos sujetos portadores de prótesis removibles y que presentan Estomatitis Sub-Protésica. Sin embargo, es necesario que se realicen nuevos estudios a fin de comprender mejor la influencia que ejerce este microorganismo en el medio ambiente bucal de la población sistemicamente normal, incluyendo a aquellos sujetos portadores de prótesis dentales removibles.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
  1. 1.- BUDTZ-JORGENSEN E. Etiology, pathogenesis, therapy and prophylaxis of oral yeasts infections. Acta Odontol Scand 1990; 48: 61-9.

  2. JENNINGS KJ, MAC DONALD DG. Histological, microbiological and haematological investigations in denture-induced stomatitis.J Dent 1990; 18.102-6.

  3. WEBB BC, THOMAS CJ, WILLCOX MDP, HARRY DWS, KNOX KW. Candida-associated denture stomatitis. Aetiology and management: A review. Part 1. Factors influencing distribution of Candida species in the oral cavity. Aust Dent J 1998; 43: 45-50.

  4. WILSON J. The aetiology, diagnosis and management of denture stomatitis. Brit Dent J 1998; 185: 380-4.

  5. IACOPINO AM, WATHEN W. Oral Candidal Infection and Denture Stomatitis: A Comprehensive Review. JADA 1992; 123: 46-51.

  6. MOREIRA E, BERNAL A, PRADO M, CATALÁ F. Asociación entre el Grado Clínico de la Estomatitis Subprótesis y las alteraciones del Epitelio de la Mucosa Palatina. Rev Cubana Estomatol 1992; 29 (2): 75-80.

  7. THOMAS JE, LLOYD PM. Oral Candidiasis in the elderly. Spec Care Dent 1985; 5 (5): 222-5.

  8. CATALÁN A. Stomatitis associees au port des protheses dentaires amovibles: etiologie et traitments. Cah Prothese 1984 ; 12 (46) : 59-78.

  9. WEBB BC, THOMAS CJ, WILLCOX MDP, HARRY DWS, KNOX KW. Candida-associated denture stomatitis. Aetiology and management: A review. Part 2. Oral diseases caused by Candida species. Aust Dent J 1998; 43 (3): 160-6.

  10. BERGENDAL T. Status and treatment of denture stomatitis patients: a 1 year follow-up study. Scand J Dent Res 1982; 90: 227-38.

  11. VIGLID M. Oral mucosal lesions among institutionalized elderly in Denmark. Comm Dent Oral Epidemiol 1987; 15: 309-17.

  12. JEGANATHAN S, PAYNE J, THEAN H. Denture stomatitis in an elderly edentulous Asian population. J Oral Rehab 1997; 24: 468-72.

  13. MC CORD JF, GRANT AA. Pre-definitive treatment: rehabilitation prostheses. Brit Dent J 2000; 188: 419-24.

  14. ARENDORF TM, WALKER DM. Candida albicans: its association with dentures, plaque and the oral mucosa. J of the D A S A 1980; 35: 563-9.

  15. NANETTI A, STANCARI F, FERRI M, MAZZONI A. Relationship between Candida albicans and denture stomatitis: a clinical and microbiological study. Microbiologica 1993; 16 (3): 287-91.

  16. PARDI G, CARDOZO E, PERRONE M, SALAZAR E. Detección de especies de Candida en pacientes con Estomatitis Sub-Protésica. Acta Odontológica Venezolana 2001; 39 (3): 32-44.

  17. BARBEAU J, SEGUIN J, GOULET JP, DE KONINCK L, AVON SL, LALAONDE B, DESLAURIERS N. Reasseding the presence of Candida albicans in denture-related stomatitis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Radiol Endod 2003; 95 (1): 51-9.

  18. DAR-ODEH NS, SHEHABI AA. Oral candidiosis in patients with removable dentares. Mycoses 2003; 46 (5-6): 187-81.

  19. RAMAGE G, TOMSETT K, WICKES BL, LÓPEZ-RIBOT JL, REEDING SW. Denture Stomatitis: a role for Candida biofilms. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Radiol Endod 2004; 98 (1): 53-9.

  20. CROCKETT DN, O´GRADY JF, READE PC. Candida species and Candida albicans morphotypes in erythematous candidiasis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1992; 73: 559-63.

  21. MOSCA CO, MORAGUES MD, BRENA S, ROSA AC, PONTON J. Isolation of Candida dubliniensis in a teenager with denture stomatitis. Med Oral Pathol Oral Cir Bucal 2005; 10 (1): 28-31.

  22. COLEMAN DC, SULLIVAN DJ, BENNETT DE et al. Candidiasis : the emergence of a novel species, Candida dubliniensis. AIDS 1997 ; 11 : 557-67.

  23. SULLIVAN D, HAYNES K, BILLI J, BOERLIN P, RODERO L, LLOYD S, HENMAN M, COLEMAN D. Widespread geographic distribution of oral Candida dubliniensis strains in human immunodeficiency virus-infected individuals. J Clin Microbiol 1997; 35: 960-4.

  24. MEIS JF, RUHNKE M, DE PAUW BE, ODDS FC, SIEGERT W, VERWEIJ PE. Candida dubliniensis candidemia in patients with chemotherapy-induced neutropenia and bone marrow transplantation. Emerg Infect Dis 1999; 5: 150-3.

  25. SALESA R, MORAGUES MD, ROSA AC, PEMÁN J, QUINDÓS G, PONTÓN J. Specific antibody response in a patient with Candida dubliniensis fungemia. Rev Iberoam Micol 2001; 18: 42-4.

  26. SULLIVAN D, WESTERNENG T, HAYNES K, BENNETT D, COLEMAN D. Candida dubliniensis sp. nov.: phenotypic and molecular
    characterization of a novel species associated with oral candidiosis in HIV-infected individuals. Microbiology 1995; 141: 1.507-21.

  27. SULLIVAN DJ, MORÁN G, DONNELLY S, GEE S, PINJON E et al. Candida dubliniensis: an update. Rev Iberoam Micol 1999; 16: 72-6.

  28. ODDS FC, BERNAERTS R. CHROMagar Candida, a New Differential Isolation Medium for Presumptive Identification of Clinically Important Candida species. J Clin Microbiol 1994; 32 (8): 1.923-9.

  29. PINCUS DH, COLEMAN DC, PRUITT WR, PADHYE AA, SALKIN IF et al. Rapid Identification of Candida dubliniensis with Commercial Yeast Identification Systems. J Clin Microbiol 1999; 37 (11): 3.533-9.

  30. AL MOSAID A, SULLIVAN D, SALKIN I, SHANLEY D, COLEMAN D. Differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans on Staib Agar and Caffeic Acid-Ferric Citrate Agar. J Clin Microbiol 2001; 39 (1): 323-7.

  31. MATA-ESSAYAG S, HARTUNG DE CAPRILES C, SÁNCHEZ L, GALLARDO S, PÉREZ C et al. Aislamiento de Candida dubliniensis en Venezuela. Antib e Inf 2002; 10 (4): 165-70.

  32. HARTUNG DE CAPRILES C, MATA-ESSAYAG S, PÉREZ C, COLELLA MT, ROSELLÓ A, OLAIZOLA C, MAGALDI S, ABATE T. Detection of Candida dubliniensis in Venezuela. Mycopathologia 2005; 160: 227-34.

  33. BEIGHTON D, LUDFORD R, CLARK D, BRALISFORD S, PANKHURST C, TINSLEY G, FISKE J et al. Use of CHROMagar Candida medium for isolation of yeasts from dental samples. J Clin Microbiol 1995; 33 (11): 3.025-7.

  34. MAROT-LEBLOND A, BEUCHER B, NAIL-BILLAUD S, ROBERT R. Development and Evaluation of Rapid Latex Agglutination Test Using a Monoclonal Antibody To Identify Candida dubliniensis Colonies. J Clin Microbiol 2006; 44 (1): 138-42.

  35. SILVA-LORETO E, SCHEID L, NOGUEIRA C, ZENI G, SANTURIO J, ALVES S. Candida dubliniensis: Epidemiology and Phenotypic Methods of Identification. Mycopathologia 2010; 169: 431-43.

  36. FEO M. Candida albicans. Formación rápida de Clamidosporos. Revista Dermatología Venezolana 1964; Vol IV (3-4): 235-7.

  37. COLEMAN DC, RINALDI MG, HAYNES KA, REX JH, SUMMERBELL RC, ANAISSIE EJ, LI A, SULLIVAN DJ. Importance of Candida species other than Candida albicans as opportunistic pathogens. Medical Mycology 1998; 36 Suppl 1: 156-65.

  38. PINEDA G, SCOLLO K, SANTISO G, LEHMANN E, ARECHAVALA A. Aislamiento de Candida dubliniensis en distintos materiales clínicos. Análisis de métodos fenotípicos de diferenciación con Candida albicans. Rev Argent Microbiol 2008; 40: 211-17.

  39. AL- MOSAID A, SULLIVAN D, COLEMAN D. Differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans on Pal´s Agar. J Clin Microbiol 2003; 41 (10): 4.787-9.

  40. SLIFKIN M. Tween 80 opacity test responses of various Candida species. J Clin Microbiol 2000; 38: 4.626-8.

  41. ALVES SH, DE LORET ES, LINARES CE, SILVEIRA C, SCHEID LA, PEREIRA DB, et al. Comparison among tomato juice agar with other three media for differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2006; 48: 119-21.

  42. PINJON E, SULLIVAN D, SALKIN I, SHANLEY D, COLEMAN D. Simple inexpensive reliable method for differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans. J Clin Microbiol 1998; 36: 2.093-5.

  43. SAHAND I, MORAGUES M, ROBERT R, QUINDÓS G, PONTÓN J. Evaluation of Bichro-Dubli Fumouze® to distinguish Candida dubliniensis from Candida albicans. Diagn Microbiol Infect Dis 2006; 55: 165-7.

  44. PARDI G, CARDOZO E, PERRONE M, SALAZAR E. Detección de especies de Candida en casos de recidiva de pacientes con Estomatitis Sub-Protésica, medicados con Miconazol Jalea Oral. Acta Odontológica Venezolana 2.003; 41(2): 108-19.

  45. BUDTZ-JORGENSEN E, STENERUP A, GRABOWSKI M. An epidemiologic study of yeasts in elderly denture wearers. Community Dent Oral Epidemiol 1975; 3: 115-9.

  46. FIGUEIRAL MH, AZUL A, PINTO E, FONSECA PA, BRANCO FM, SCULLY C. Denture-related stomatitis: identification of aetiological and predisposing factors - a large cohort. J Oral Rehabil 2007; 34: 448-55.

  47. GASPAROTO TH, DIONISIO TJ, OLIVEIRA CE, PORTO VC, GELANI V, SANTOS CF, CAMPANELLI AP, SOARES LARA V. Isolation of Candida dubliniensis from denture wearers. J Med Microbiol 2009; 58: 959-62.

  48. MARCOS-ARIAS C, VICENTE JL, SAHARD IF, EGUIA A, DE-JUAN A, MADANAGA L et al. Isolation of Candida dubliniensis in denture stomatitis. Arch Oral Biol 2009; 54: 127-31.

  49. ODDS FC, DAVIDSON A. "Room Temperature" use of CHROMagar Candida. Diagn Microbiol Infect Dis 2000; 38: 147-50.

  50. FREYDIERE AM, GUINET R, BKOIRON P. Yeast identification in the clinical microbiology laboratory: phenotypical methods. Med Mycol 2001; 39: 9-33.

  51. SULLIVAN D, COLEMAN D. Candida dubliniensis: Characteristics and identification. J Clin Microbiol 1998; 36: 329-34.

  52. BALLESTÉ R, ARTETA Z, FERNÁNDEZ N, MIER C, MOUSQUÉS N, XAVIER B, et al. Evaluación del medio cromógeno CHROMagar Candida TM para la identificación de levaduras de interés médico. Rev Méd Urug 2005; 21: 186-93.

  53. LÓPEZ C, GIRO L, RAMOS L, RAMADÁN S, BULACIO L. Comparación de diferentes métodos para la identificación de especies del género Candida. Rev Argent Microbiol 2005; 37: 16-21.

  54. ODDS FC, VAN NUFFEL L, DAMS G. Prevalence of Candida dubliniensis isolates in a yeast stock collection. J Clin Microbiol 1998; 36: 2.869-73.

  55. TINTELNOT K, HAASE G, SEIBOLD M, BERGMANN F, STAEMMLER M, FRANZ T, et al. Evaluation of phenotypic markers for selection and identification of Candida dubliniensis. J Clin Microbiol 2000; 38: 1.599-608.

  56. KHAN ZU, AHMAD S, MOCADAS E, CHADY R. Tobacco agar, a new medium for differentiating Candida dubliniensis from Candida albicans. J Clin Microbiol 2004; 42: 4.796-8.

  57. GALES AC, PFALLER MA, HOUSTON AK, JOLY S, SULLIVAN DJ, COLEMAN DC, et al. Identification of Candida dubliniensis based on temperature and utilization of xilose and alphamethil-D-glucoside as determined with the API 20CAUX and Vitek YBC systems. J Clin Microbiol 1999; 37: 3.804-8.

  58. ZWADYK P, TALTON RA, PROCTOR A. Evaluation of API 20C for identification of yeasts. Amer J Clin Pathol 1977; 67: 269-71.

  59. BUESCHING WJ, KUREK K, ROBERTS GD. Evaluation of the Modified API 20 C System for Identification of Clinically Important Yeasts. J Clin Microbiol 1979; 9: 565-9.

  60. LAND GA, HARRISON BA, HULME KL, COOPER BH, BYRD JC. Evaluation of the New API 20C Strip for Yeast Identification Against a Conventional Method. J Clin Microbiol 1979; 10 (3): 357-364.

  61. SHINODA T, KAUFMAN L, PADHYE A. Comparative Evaluation of the Iatron Serological Candida Check Kit and the API 20C Kit for Identification of Medically Important Candida Species. J Clin Microbiol 1981; 13 (3): 513-8.

  62. GIULIANA G, PIZZO G, MILICI ME, GIANGRECO R. In vitro activities of antimicrobial agents against Candida species. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1999; 87 (1): 44-9.

  63. WILLIAMS MD, LEWIS MAO. Isolation and identification of Candida from the oral cavity. Oral Diseases 2000; 6: 3-11.

  64. LIGUORI G, DI ONOFRIO V, LUCARIELLO A, GALLE F, SIGNORIELLO G, COLELLA G, D'AMORA M, ROSSANO F. Oral candidiasis: a comparison between conventional methods and multiplex polymerase chain reaction for species identification. Oral Microbiol Immunol 2009: 24: 76-8.

  65. SANCAK B, REX JH, PAETZNICK V, CHEN E, RODRÍGUEZ J. Evaluation of method for identification of Candida dubliniensis bloodstream isolates. J Clin Microbiol 2003; 41: 489-91.

  66. JABRA-RIZK MA, FALKLER WA, MERZ WG, KELLEY JI, BAQUI AAMA, MEILLER TF. Coaggregation of Candida dubliniensis with Fusobacterium nucleatum. J Clin Microbiol 1999; 37: 1.464-8.

  67. TRONCHIN G, BOUCHARA JP, ROBERT R, SENET JM. Adherence of Candida albicans Germ Tubes to Plastic: Ultrastructural and Molecular Studies of Fibrillar Adhesins. Infect Immun 1988; 56 (8): 1.987-93.

  68. VASILAS A, MOLINA L, HOFFMAN M, HAIDARIS CG. The influence of morphologicall variation on Candida albicans adhesion to denture acrylic in vitro. Archs Oral Biol 1992; 37: 613-22.

  69. EDGERTON M, SCANNAPIECO FA, REDDY MS, LEVINE MJ. Human Submandibular-Sublingual Saliva Promotes Adhesion of Candida albicans to Polymethylmethacrylate. Infect Immun 1993; 61 (6): 2.644-52.

  70. CRITCHLEY IA, DOUGLAS LJ. Isolation and partial characterization of an adhesin from Candida albicans. J Gen Microbiol 1987; 133: 629-36.

  71. ELLEPOLA AN, SAMARANAYAKE LP. Adhesion of oral Candida albicans isolates to denture acrylic following limited exposure to antifungal agents. Archs Oral Biol 1998; 43: 999-1.007.

  72. ELGUEZABAL N, MAZA JL, PONTÓN J. Inhibition of adherence of Candida albicans and Candida dubliniensis to a resin composite restorative dental material by salivary secretory IgA and monoclonal antibodies. Oral Diseases 2004; 10: 81-6.

  73. MOURA JS, DA SILVA WJ, PEREIRA T, DEL BEL CURY AA, GARCIA, RCR. Influence of acrylic resin polymerization methods and saliva on the adherence of four Candida species. J Prosthet Dent 2006; 96: 205-11.

  74. MARSH P, MARTIN M.: Oral Microbiology. 5 ed. London, Great Britain. EdItorial Wright: 1999.