Trabajos Originales

Recibido para Arbitraje: 09/11/2009
Aceptado para Publicación:10/11/2010

Guilarte, C., Profesor Asociado. Pardi, G., Profesor Titular. Perrone M., Profesor Titular. Cátedra de Microbiología, Facultad de Odontología de la Universidad central de venezuela.

INTRODUCCIÓN

Muchas de las técnicas convencionales de identificación de especies de Candida se basan en pruebas rápidas y bioquímicas que requieren al menos 72 horas o más para su correcta interpretación. En los últimos años se han desarrollado medios de cultivo que permiten la identificación presuntiva de distintas especies en función de la coloración, textura y morfología de las colonias en el medio de cultivo, en 24-48 horas. ^1,2,3. Actualmente existen en el mercado una gran variedad de medios diferenciales, los cuales contienen sustratos cromogénicos que permiten, al crecer los microorganismos, dar origen a colonias de distintos colores y en algunos casos con morfologías diferentes, que pueden diferir en cuanto a su sensibilidad, especificidad y costo, entre estos tenemos: CHROMagar Candida, Agar Candida Cromogénico, Candida ID, Albicans ID, Chromalbicans Agar, Chromogenic Candida Agar, Fluoroplate Candida, Agar SDCA-MUAG. ^{4,5,6,7,8,9,10,11}

De los medios mencionados anteriormente, el Agar Candida Cromogénico de Oxoid (ACCO) ha sido recomendado, debido a la facilidad de su uso, así como por permitir identificar las especies de Candida de mayor importancia clínica. Se trata de un medio diferencial selectivo que emplea dos cromógenos, que indican la presencia de las enzimas X-NAG (5-bromo-4-cloro-3-indol N acetil B-D-glucosamida) y BCIP (5-bromo-6-cloro-3-indol fosfatasa p-toloudine), que detectan la actividad de las enzimas hexosaminidasa y fosfatasa alcalina respectivamente, las cuales permite diferenciar las colonias de C. albicans de las de C. tropicalis, C. krusei y de otras especies importantes de Candida, en un lapso no mayor de 24 horas.^12,13

En el Laboratorio de la Cátedra de Microbiología, la identificación de especies de Candida se ha realizado a través de las pruebas rápidas convencionales, formación del tubo germinal y de clamidosporas. Sin embargo, no son totalmente confiables ya que algunas especies de Candida, como Candida tropicalis, Candida parapsilosis y Candida dubliniensis pueden producir estructuras similares a tubos germinales y clamidosporas, así también, existen estudios que indican que alrededor del 5% de las cepas de C. albicans no forman tubo germinal.^3,14,15,16 Estas pruebas, aunque han sido de gran utilidad en el laboratorio, se limitan solo a identificar C. albicans de otras especies de Candida no albicans, por lo que las especies no albicans son reportadas sólo como Candida spp., resultados que estaríamos entregando hoy día incompletos, si comparamos lo que sugiere la literatura actual en lo que al diagnostico micológico se refiere.

Aunado a ello, a pesar que se ha demostrado en nuestro país la frecuencia e importancia de las especies de Candida en la etiología de diversas infecciones en la cavidad bucal, ^17,18,19 en la Facultad de Odontología de la UCV, no se tiene un esquema de de rutina para detectar e identificar otras especies de Candida diferentes a C. albicans a partir de muestras en cavidad bucal, sino que soló se ha llegado hasta la identificación presuntiva de dicho microorganismo. Por lo anteriormente expuesto, el objetivo del presente trabajo fue detectar e identificar especies de Candida  en  Agar Candida Cromogénico (ACCO), en cepas de levaduras correspondientes a aislamientos de muestras de lesiones en mucosa bucal.


MATERIALES Y MÉTODOS

Se estudiaron en el laboratorio de la Cátedra de Microbiología un total de 70 cepas de levaduras correspondientes a aislamientos de muestras de lesiones en mucosa bucal con diagnóstico clínico presuntivo de Estomatitis Subprotésica (E.S.P) y Candidiasis de pacientes provenientes del Servicio de Clínica Estomatológica y del Centro de Atención de Pacientes con Enfermedades Infectocontagiosas (CAPEI) de la Facultad de Odontología de la UCV.


OBTENCIÓN DE LAS CEPAS:

Las cepas de levaduras fueron obtenidas de las muestras mencionadas anteriormente aisladas en Agar Dextrosa Sabouraud e identificadas en su mayoría como Candida spp. por métodos micológicos convencionales que incluían, la observación de la morfología macroscópica y microscópica, y las pruebas rápidas, Producción de Tubo Germinal (Filamentización en suero) y producción de Clamidosporas.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE Candida: Para la detección del Tubo Germinal se sembró una porción de colonia con el asa de platino previamente esterilizada en tubos conteniendo 0,5 ml de suero humano; dichos tubos fueron incubados en la estufa a 37 °C por 2 horas, al cabo de las cuales se tomó una muestra del mismo para la observación microscópica al fresco, empleando para ello el microscopio óptico con objetivo de 10X y 40X. Para la detección de Clamidosporas se empleó el medio de Bilis Agar, en el cual se sembró una porción de la colonia y se incubó a 28 °C por 48 a 72 horas, al cabo de las cuales, se tomó una muestra del medio para realizar la observación microscópica al fresco, empleando para ello el microscopio óptico con objetivo de 10X y 40X.

SIEMBRA DE LAS CEPAS en Agar Candida Cromogénico (Oxoid) (ACCO): Cada una de las cepas fue sembrada en el medio de cultivo ACCO contenidos en placas de Petri para el crecimiento de especies de Candida y posteriormente fueron incubadas en estufa a una temperatura de 30 °C por 24-72 horas, en condiciones de aerobiosis. En los casos donde hubo crecimiento de levaduras, se tomó una pequeña porción de colonia con un asa de platino previamente esterilizada y se sembró en nuevos medios ACCO extendiendo por toda la superficie del medio para la obtención de las cepas puras, con la finalidad de permitir el crecimiento de colonias separadas sobre la superficie del medio, lo cual facilitó su identificación. Luego que se realizaron las siembras en los medios de cultivo fueron incubados a una temperatura de 30 °C por 24-72 horas en condiciones de aerobiosis.

OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA: Luego de pasado el tiempo de incubación de los medios conteniendo la cepa previamente sembrada, se uno de los medios para determinar las características del crecimiento de las colonias de las diferentes especies de Candida y se realizó un examen directo, entre lámina y laminilla, y extendidos teñidos con la coloración de Gram, con la finalidad de determinar la presencia de levaduras, empleando para ello el microscopio óptico con objetivo de 40x. Las colonias fueron caracterizadas por medio de la observación a simple vista y a través del microscopio estereoscópico, tomando en cuenta: color, forma, tamaño y consistencia de las mismas realizaron observaciones macroscópicas de cada.

CEPAS Y PATRONES CONTROLES: El patrón para la identificación de las especies de Candida en el medio ACCO fue tomado de la casa comercial Oxoid. Las cepas controles del Género Candida utilizadas para este estudio fueron suministradas por Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel" perteneciente al Ministerio de Salud. El Sistema API 20 CAUX (bioMérieux) se utilizó para corroborar los aislamientos que presentaron colonias presuntivas de C. kefyr, C. parapsilopsis, C. glabrata y C. lusitaniae. A partir de las colonias puras, se realizaron subcultivos en Agar Dextrosa Sabouraud y se incubaron en estufa a 37 °C por 24 horas en aerobiosis con el fin de trabajar con cultivos frescos. Una vez purificadas las colonias se procedió a efectuar la identificación, a través del sistema API 20 CAUX, el cual permitió corroborar las especies mencionadas anteriormente. Con ayuda de una varilla de vidrio, se tomó una fracción de colonia del cultivo fresco en Agar Sabouraud Dextrosa y se preparó una suspensión en la ampolla que contiene el medio con una turbidez Nº 2 del densitómetro. Seguidamente se homogeneizó la ampolla y sé procedió a inocular la galería, distribuyendo 100 l de suspensión por cúpula con una pipeta para tal fin. Luego se taparon las galerías y se incubaron en estufa a 30°C durante 48-72 horas en aerobiosis. Después de 48 a 72 horas de incubación se observó el crecimiento de las levaduras comparativamente con la cúpula control negativo (cúpula 0) y se procedió a la lectura de las mismas. Una cúpula con mayor turbidez que la de control nos indicó una reacción positiva. Finalmente la identificación se realizó a partir del perfil numérico obtenido a partir de las reacciones positivas de cada prueba de asimilación e inmediatamente dicho perfil fue introducido en el Software de Identificación (bioMérieux) incorporado a la computadora a través del teclado para obtener la especie correspondiente de cada cepa en estudio.


RESULTADOS

Del total de las 70 cepas estudiadas, 82 (100,00%) especies fueron detectadas e identificadas, de ellas, 50 (60,98 %) correspondieron a C. albicans, 10 (12,20 %) a  C. tropicalis,  6  (7,32 %) a C. glabrata, 6 (7,32%) a C. krusei,  5 (6,10 %) a C. kefyr, 3 (3,66 %) a C. parapsilopsis y 2 (2,44 %) a C. lusitaniae (Tabla 1).

Del total de las cepas de levaduras de especies de Candida  estudiadas, se obtuvieron 24 cultivos mixtos, donde se observaron colonias características de C. albicans mas C. tropicalis (25,00), C. albicans más C. glabrata (25,00 %), C. albicans mas C. kefyr (8,33 %), C. albicans mas C. lusitaniae (8,33 %), C. tropicalis mas  C. lusitaniae (8,33 %) y C. tropicalis mas C. krusei (25,00 %) (Tabla 2), y en el resto de los 58 cultivos solo se observó crecimiento característico de una sola especie (Tabla 3).

El crecimiento levaduriforme, en el medio ACCO fue claramente evidenciado, por la aparición de colonias características en la superficie del agar, después 24 a 48 horas de incubación en aerobiosis. El desarrollo observado en las colonias en el medio, nos permitió determinar el color, la textura y la macromorfología de las mismas. El morfotipo observado en las colonias de los aislamientos nos permitió asignar a cada una de las cepas estudiadas la especie correspondiente: 50 aislamientos con colonias típicas de color  verde como C. albicans; 10 aislamientos con colonias azules oscuras como     C. tropicalis; 6 aislamientos con  colonias color  rosa vieja con halo de característica rugosa irregular como C. krusei. Los aislamientos restantes presentaron colonias color marrón presuntivo de C. kefyr y C. parapsilopsis, amarillas claras presuntivo de C. glabrata,   2 aislamientos con colonias color lila finas presuntivas de C. lusitaniae (Figura 2). Al realizar las observaciones microscópicas de las colonias en el examen directo y los extendidos teñidos con Gram, se visualizaron células levaduriformes características del Género Candida. Utilizando el sistema comercial API 20 CAUX (bioMerieux), fueron corroborados los aislamientos que presentaron colonias presuntivas de C. kefyr, C. parapsilopsis, C. glabrata y C. lusitaniae. Por este ensayo fueron identificadas las 6  (7,32 %) cepas de  C. glabrata,  5 (6,10 %) de C. kefyr, 3 (3,66 %) de C. parapsilopsis y 2 (2.44 %)  de C. lusitaniae del total de las cepas obtenidas.

DISCUSIÓN

El Género Candida comprende varias especies de levaduras, C. albicans y otras  especies de Candida no albicans, que pueden encontrarse formando parte de la microbiota normal de la cavidad bucal (lengua, paladar, mucosa bucal). No obstante estos microorganismos están ampliamente implicados en la etiología y desarrollo de diversas infecciones en la cavidad bucal, siendo C. albicans el microorganismo mas frecuentemente detectado ^1,2, lo cual ha sido bien documentado por trabajos realizados en nuestro país. ^17,18,19

En el presente estudio se analizaron un total de 70 cepas de especies de Candida. Del total de las cepas estudiadas, 82 (100,00%) especies fueron detectadas e identificadas, de ellas, 50 (60,98 %) correspondieron a C. albicans, 10 (12,20 %) a C. tropicalis,  6  (7,32 %) a C. glabrata, 6 (7,32%) a C. krusei, 5 (6,10 %) a C. kefyr, 3 (3,66 %) a C. parapsilopsis  y 2 (2,44 %) a C. lusitaniae.Estos resultados coinciden con otros reportes en cuanto a que estas levaduras se encuentran entre las más frecuentes implicadas en lesiones de mucosa bucal con diagnóstico presuntivo de ESP y Candidiasis que han sido identificadas a través de técnicas convencionales, pruebas rápidas y diferentes sistemas comercia ^{17,18,19,20,21,22,23}

A partir de 1997, Pardi y col., comenzaron a identificar la presencia de especies de Candida presentes en 30 pacientes con ESP., que asistieron al Servicio de Clínica Estomatológica de la Facultad de Odontología de la UCV a través de la observación de las colonias de levaduras en Agar Sabouraud, tubos germinales y clamidosporas, así como en la realización de pruebas rápidas de asimilación de carbohidratos mediante el sistema API 20CAUX (BioMerieux). Los resultados de este estudio demostraron que C. albicans  fue la especie más frecuentemente aislada en paladar (75,5%) y en prótesis de los pacientes con E.S.P (82,5%), en tanto que C. parapsilosis, C. tropicalis,   C. glabrata, C. guillermondii y C. rugosa se encontraron en una baja proporción de pacientes con esta lesión.¹⁷

Por otra parte, Lazarde y Pacheco (2001), estudiaron 40 pacientes con Candidiasis Atrófica Crónica que acudieron al Servicio de Clínica Estomatológica de la Facultad de Odontología. UCV, con la variante que utilizaron el sistema ID32C (Biomerieux), reportando que la especie más frecuentemente aislada fue en un 72,5%  C. albicans, seguidamente en un 15% C. tropicalis, 2% C. glabrata y C. famata,, C. parapsilosis y C. rugosa representaron el 1% respectivamente, concluyendo que es necesario realizar un correcto diagnóstico clínico y micológico con la identificación exacta de las levaduras con fines de establecer pautas terapéuticas correctas y evitar la resistencia a los antimicóticos.¹⁹ En el presente estudio C. albicans fue la especie más frecuentemente aislada, representó el 60,98 % de todas cepas de las levaduras analizadas y el 72,42% en cultivos solos, seguidamente C. tropicales resultados que coincide con los reportes mencionados anteriormente y con otros estudios donde la frecuencia de estos microorganismos es similar en muestras provenientes de cavidad bucal. ^21,24,25

Tradicionalmente  la identificación de especies de Candida se ha realizado a través de las pruebas rápidas convencionales, formación del tubo germinal, y formación de clamidosporas en agar bilis. Sin embargo, estas pruebas son específicas, pero no son totalmente confiables. La literatura reporta que algunas especies de Candida, como C. tropicalis, C. parapsilosis y C. dubliniensis pueden producir estructuras similares a tubos germinales y clamidosporas, así como también, existen estudios que indican que alrededor del 5% de las cepas de C. albicans no forman tubo germinal.^3,16,26 A pesar que ambas pruebas son muy rentables, sencillas y rápidas (2-4 horas) para identificar C.albicans de otras especies de Candida, deben ser interpretadas con precaución por un especialista para no confundir los tubos germinativos con hifas, teniendo en cuenta que algunas cepas de C. albicans no producen tubos germinativos y otras cepas si lo pueden producir, al igual que las clamidosporas. Estas pruebas, aunque han sido de gran utilidad en el Laboratorio de la Cátedra de Microbiología, se limitan solo a identificar C. albicans de otras especies de  Candida no albicans, por lo que las especies no albicans son reportadas sólo como Candida spp., resultados que estaríamos entregando hoy día incompletos, si comparamos lo que sugiere la literatura actual en lo que al diagnóstico micológico se refiere. Tomando en consideración lo antes expuesto, esta realidad se puede mejorar, si tomamos en cuenta que actualmente existen en el mercado otras pruebas, medios y sistemas, mas rápidos, sensibles y confiables, que nos permiten mejorar el diagnóstico micológico ya que estaríamos identificando diferentes especies de Candida en muestras provenientes de cavidad bucal en corto tiempo y de esta manera garantizar resultados mas completos. La diferencia de este estudio con las otras investigaciones es que en el presente se empleó el medio ACCO en el cual se obtuvieron los resultados en 24 a 48 horas de incubación, observándose el crecimiento característico de las colonias lo que ayuda a un diagnóstico rápido y presuntivo de las especies de Candida, que posteriormente fueron corroboradas por el sistema API 20CAUX. Esta diferencia con respecto al medio marca una ventaja sobre la utilización de las pruebas convencionales y uso del medio Agar Dextrosa Sabouraud, en cuanto a costo, practicidad y tiempo.

El ACCO es un medio diferencial selectivo que emplea dos cromógenos para la diferenciación de las colonias de C. albicans (verdes) de las de C. tropicalis (azul oscuro), C. krusei (rosado marrón), de otras especies importantes de Candida (colonias beige, amarillo y café), en una sola incubación, lo cual proporciona una diferenciación rápida de las colonias ¹³, a diferencia del tradicional Agar Dextrosa Sabouraud, que al compararlo con el ACCO, tiene la desventaja de que las características de las colonias  son similares, siendo por ello imposible determinar a cual especie de Candida pertenecen. Es importante aclarar que los 50 asilamientos que desarrollaron colonias verdes, presuntamente fueron incluidos en la especie C. albicans, aunque tal coloración también la puede presentar la especie, C. dubliniensis en medio cromogénicos, las cuales han sido descritas de color verde oscuro, mientras que las colonias de C. albicans han sido descritas como verdes.²⁷ En nuestra experiencia C. albicans formó colonias verdes de distinta intensidad, dependiendo de la densidad de crecimiento y tiempo de incubación. Por tanto es importante considerar la limitación de este medio para la diferenciación de ambas especies si la incidencia de C. dubliniensis comienza a ser significativa, ya que esta levadura ha sido aislada principalmente de candidiasis en cavidad bucal en pacientes con SIDA. ^23,27,28,29 Por este motivo, es posible que alguna de las cepas identificadas en nuestro estudio como C. albicans correspondan realmente a C. dubliniensis. C. krusei y C. glabrata, siguieron en frecuencia  en un 7,32%. Se ha encontrado que la recurrencia de casos de Candidiasis Bucal en pacientes VIH positivos en los que C. glabrata se ha identificado como agente causal, es ocasionada por este mismo microorganismo. Esta especie crece con facilidad en el medio de Sabouraud, en el que  origina unas colonias indiferenciables de la mayoría de otras especies de levaduras del mismo Género. En medios cromogénicos, como el CHROMagar, las colonias aparecen de color lila a púrpura. En nuestro estudio utilizando el ACCO se observó bien  la diferencia entre C. krusei, que dio origen a colonias color rosa vieja  irregulares con halo y C. glabrata que originó colonias amarillas claras. Los sistemas manuales o automatizados de identificación utilizados para la detección de C. glabrata suelen ser suficientemente discriminativos, ya que el patrón bioquímico de la especie la diferencia claramente de otras especies del género Candida, pero puede resultar semejante al de C. krusei, aunque son de difícil confusión porque C. krusei presenta una morfología macro y microscópica muy diferente.Gatica y col. (2002), recomiendan que para el diagnóstico de C. glabrata, se emplee algún otro sistema de identificación para confirmar la sospecha en agar Cromocandida, ya que el crecimiento de esta especie en este medio es similar al de varias especies de Candida.³⁰ Se han descrito algunos métodos rápidos, como el basado en la hidrólisis rápida de la trealosa, el cual permite la identificación de  C. glabrata. Permán y col. (2004), recomiendan la prueba GLABRATA RTT, que permite la identificación de C. glabrata en 20 minutos y por ser una técnica fiable y de fácil manejo en la rutina de laboratorio, además, hacen referencia a su utilización conjunta con CHROMagar, ya que deberían ser ensayadas solo las colonias que desarrollen una tonalidad rosa inespecífica, con el subsiguiente ahorro de tiempo y reactivos y así poder diferenciar rápidamente las especies C. glabrata y C. krusei, debido a su resistencia o menor sensibilidad al fluconazol y otros azoles.³¹ Candida lusitaniae se encontró en un 2,44% lo cual coincide con otros trabajos que reportan que la incidencia como patógeno es baja, alcanzándose frecuencias del 1-2% en las candidosis de origen nosocomial. Sin embargo, algunos autores, como Sánchez y col., han descrito porcentajes hasta de un 7% de colonización en pacientes sometidos a trasplante de médula ósea o ingresados en unidades de cuidados intensivos. Como consecuencia de la publicación de éste y de otros trabajos similares, existe una controversia, por ahora no resuelta, sobre el incremento en la frecuencia de aislamiento de esta levadura. Es posible, sin embargo, que el fenómeno sea debido a una mayor atención prestada por los laboratorios como consecuencia de las características de resistencia a la anfotericina B, aunque también podría atribuirse al aumento de la población de pacientes inmunodeprimidos, lo que lleva consigo una mayor utilización de este antifúngico. Los resultados en este estudio, posiblemente tengan esta misma relación al encontrarse que los 2 aislamientos de C. lusitaniae fueron de muestras que provenían de CAPEI.

Varios estudios que comparan y evalúan diferentes métodos para la identificación de especies de Candida han sido reportados. Odds y Bernaerts (1994), evaluaron el medio de cultivo cromogénico, CHROMAgar Candida, para el aislamiento y diagnóstico diferencial presuntivo de Candida spp. de muestras clínicas, encontrando más del 99% de eficiencia para el diagnóstico de C. albicans, C. tropicalis y C. krusei. Sin embargo, los investigadores no indican la utilidad del medio para la identificación de C. glabrata, ya que otras nueve especies de Candida, entre las que destaca por su frecuencia de aislamiento, C. famata, C. kefyr, C. krusei y C. parapsilosis, dan origen a colonias descritas de igual color, causando ambigüedad y confusión en la identificación.²⁷ Investigaciones posteriores realizadas por Giusano y Maniaterra (1998), reportan que CHROMAgar Candida puede ser un medio muy útil para la diferenciación e identificación presuntiva rápida de levaduras, tanto a partir de cepas aisladas como de muestras clínicas, lo que resulta de gran interés especialmente para el caso de pacientes inmunocomprometidos para los cuales la celeridad del diagnóstico es de fundamental importancia.28  Horvath y col. (2003), corroboran lo reportado en el trabajo anterior, pero sugieren dejar las muestras incubando hasta 96 horas para la diferenciación de C. glabrata, además reportan el ahorro de los costos en el trabajo de laboratorio.³³Quindós y col., (2001), resumen en su estudio los resultados obtenidos con diferentes medios comercializados con sustratos fluorogénicos y cromogénicos para la identificación rápida de C. albicans, concluyendo a partir de su estudio, que el medio Candida ID permite una excelente identificación de las colonias de C. albicans que crecen de color azul intenso en el medio  y se diferencia de C. dubliniensis que crecen de un color azul turquesa, no obstante dicha especie debe ser corroborada por otra técnica. También reportan que este medio ayuda a la separación presuntiva de C. tropicalis, C. lusitaniae, C. guillermondii y C. kefyr que crecen como colonias color rosa, pudiendo ser utilizado para el proceso de muestras clínicas en las que se sospecha la presencia de levaduras de Candida. ³⁴ Por otra parte, Godoy y col. (2001), evaluaron la eficiencia el medio Cromogénico Candida ID en aislamientos de levaduras y en vista de los resultados obtenidos indican que a pesar de ser un medio de fácil uso y sencilla interpretación, la incidencia de resultados falsos positivos con diferentes especies de levaduras limitan su utilización en la rutina de identificación de C.albicans. Reportan también que C. tropicalis es la que presenta mayor problema, siendo los falsos positivos frecuentes en este medio. ²⁴ En el año 2003, Ruiz y col., realizaron un estudio donde evaluaron  la nueva fórmula del medio CHROMagar Candida (CHROM-R) frente a la fórmula del original (CHROM-O), considerando la capacidad de crecimiento y morfotipo de las colonias, y posteriormente realizaron un estudio comparativo del medio reformulado con un nuevo medio de similar composición de otra casa comercial (MAIM, Izasa) (CHROM-M). Los resultados obtenidos indican que el medio reformulado permite la posibilidad de distinguir entre C. albicans y C. dubliniensis, no teniendo esta capacidad el medio original, ni el nuevo medio CHROM-M.  El medio CHROMagar de MAIM no demostró la misma eficacia para la identificación de especies de levaduras que el medio CHROMagar Candida de Becton-Dickinson, ya que presenta una menor sensibilidad, necesita un mayor tiempo de incubación para que las colonias se desarrollen y dificulta la diferenciación de algunas especies de interés clínico como C. tropicalis y C. parapsilosis. No es tampoco un medio apropiado para la identificación de C. dubliniensis, siendo el color de ésta semejante al de C. albicans. El medio CHROM-R presenta frente a éste, sin duda, una mayor sensibilidad y especificidad para la identificación de C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis y C. dubliniensis. En vista de ello, y dado que el medio cromogénico CHROMagar Candida reformulado de Becton-Dickinson ha sido bien evaluado por otros autores (Garcia y col., 1998; San y col., 1996; Odds y col., 1994¸ Jabra y col., 2001), y el nuevo medio CHROMagar de MAIM no mejora las características de los anteriores, este  grupo de investigación sigue utilizando en el trabajo rutinario de laboratorio el medio CHROMagar Candida reformulado.³⁵

En un estudio realizado por López y col. (2005), se realizaron hisopados de la mucosa bucal de pacientes que presentaban lesiones características de candidiasis, de allí se analizaron  64 muestras resultando 44 (69%) positivas, de ellas se aislaron 27 (61%) cepas de C. albicans, 10 (23%) de C. parapsilosis, 3 (7%) de C. tropicalis, 2 (4,5%) de C. krusei y 2 (4,5%) de C. glabrata.  Al comparar las técnicas que utilizaron para  identificar C albicans (agar harina de maíz y formación de tubos germinativos) indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre ambos métodos, así mismo comparando los métodos que discriminan especies de Candida, entre ellas CHROMagar, API 20C AUX y PCR fingerprinting. Se observó que no existen diferencias significativas en las proporciones de resultados que identifican las especies de Candida entre estas pruebas. La prueba de tubo germinativo, solo  permitió identificar rápidamente a C. albicans, pero no así inferir sobre la identidad de los demás aislamientos. La prueba de clamidoconidias en agar harina de maíz  permitió corroborar la especie C. albicans, pero dicha presunción tuvo únicamente valor taxonómico orientativo, dado que C. dubliniensis también desarrolla clamidoconidias en este medio. Las pruebas bioquímicas o fisiológicas de asimilación de sustancias hidrocarbonadas y nitrogenadas, así como también las pruebas de fermentación de carbohidratos arrojaron algunos resultados dispares entre las cepas estudiadas. Utilizando el sistema comercial API 20C AUX, de los 44 aislamientos clínicos estudiados 43 (98%), presentaron perfiles de comportamiento coincidente       con    el    catálogo analítico del proveedor.²⁵ EL desarrollo observado en las colonias sembradas en el medio agar cromogénico CHROMagar, permitió determinar el color, la textura y la macro morfología de las mismas, lo cual  permitió, en algunos casos, en forma presuntiva asignar a cada uno la especie correspondiente y en la técnica de PCR fingerprinting se observó polimorfismo entre los patrones de bandas de los distintos aislamientos clínicos y en  algunos casos se observaron ligeras diferencias en las intensidades de las bandas entre miembros de una misma especie o entre distintas reacciones, que fueron atribuidas a ligeras variaciones en las condiciones de reacción.²⁵ Por otra parte, Baalham y col. (2005), compararon el nuevo medio ACCO con los medios CHROMagar Candida y Candida ID y concluyen que el ACCO es mas especifico para la detección y diferenciación de C.albicans de otras especies No albicans que el CHROMagar después de 24 horas de incubación y  a su vez ambos medios son mas específicos que el medio Candida ID, por lo que recomiendan el medio ACCO para la diferenciación y identificación presuntiva de las especies de Candida de importancia clínica.¹² Posteriormente, Baixench y col. (2006), evaluaron el nuevo medio Cromogénico ACCO para la identificación de C. albicans, C. tropicalis y C. krusei, usando como medio de referencia el medio agar cromogénico CHROMagar. Los investigadores concluyeron que el ACCO es un medio que permite el crecimiento de las levaduras más importantes y es muy útil para la diferenciación de especies de Candida en muestras clínicas y cultivos mixtos.¹³ Recientemente, Aveldañez  y col. (2008), reportan que la frecuencia de portadores de Candida en la mucosa oral es elevada y diversos factores condicionan este estado de portador. C. albicans es aún la especie que más se aísla en la cavidad oral, además indica que los métodos cromegénicos, son sensibles y específicos, y permiten una identificación fácil y rápida.⁴¹

En este estudio, del total de las cepas de levaduras de Candida spp. analizadas, se obtuvieron 24 cultivos mixtos en ACCO, donde se observaron colonias características de C. albicans más C. glabrata  (25,00 %),  C. albicans más C. tropicalis (8,33 %), C. albicans más C. kefyr (8,33 %), C. albicans más C. lusitaniae (8,33 %), C. tropicalis más  C. lusitaniae (8,33 %) y C. tropicalis más C. krusei (25,00 %), y el resto de los 54 cultivos solo se observo crecimiento característico de una sola especie. Es importante destacar estos resultados ya que este medio nos ofreció la gran ventaja de poder aislar e identificar más de una cepa de levaduras provenientes  de muestras de cavidad bucal con flora polifúngica. Quiere decir, que dentro de una misma muestra pueden estar presentes distintas especies que poseen una actividad enzimática característica que ofrece distintas tonalidades de color al actuar sobre los sustratos cromogénicos del medio, dichos resultados coinciden con algunas publicaciones que indican que los medios cromogénicos son útiles para la identificación de una o mas  especies de Candida  en muestras clínicas.^27,35,39,40. En nuestro caso, el sistema API 20 CAUX (bioMérieux), resultó ser muy específico, al corroborar las especies de Candida detectadas en el ACCO, lo que permite reafirmar el hecho de que siguen siendo, las pruebas de fermentación y asimilación de compuestos de carbono las más utilizadas para la corroboración e identificación de levaduras. El auxonograma o capacidad de las levaduras para utilizar o asimilar diferentes compuestos de carbono es hoy día es el criterio taxonómico más aceptado. Los resultados de nuestro estudio permiten sugerir la necesidad de efectuar la identificación de las especies de Candida de muestras de la cavidad bucal, ya que un tercio de ellas correspondieron a Candida spp. El uso combinado de la prueba de tubo germinativo y  el empleo del ACCO permitiría identificar correctamente a la mayoría de especies, entre estas: C. albicans, C. tropicalis,  C. krusei,  C. glabrata C.  parapsilopsis, C. lusitaniae  y C. kefyr en muestras provenientes de cavidad bucal.


CONCLUSIONES

Las especies de Candida detectadas en ACCO a partir de cepas provenientes de muestras de cavidad bucal fueron; C.albicans (60,98%), C. tropicalis (12,20 %)., C. glabrata (7,32%), C. krusei (7,32%), C. kefyr (6,10%), C. parapsilopsis (3,66%) y C. lusitaniae (2,44%), siendo C. albicans fue la especie más frecuentemente aislada.

El ACCO, es un medio practico y de fácil uso, para la detección de especies de Candida, tanto en cultivos puros o mixtos. El morfotipo observado en las colonias, después de 24 a 48 horas de incubación, nos permitió asignar a cada una de las cepas estudiadas la especie correspondiente: colonias típicas de color verde como C. albicans; de color azul oscuras como C. tropicalis; de color rosa vieja con halo de característica rugosa irregular como C. krusei. Las colonias que presentaron colonias color marrón fueron presuntivas de C. kefyr y C. parapsilopsis, amarillas claras de C. glabrata, y colonias color lila finas de C. lusitaniae.