López T: Estudiante postgraduado de la Maestría de Medicina Estomatológica
Perrone M: Profesor Titular, Jefe de Laboratorio de Microbiología, Instituto de Investigaciones Odontológicas Raúl Vincentelli, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela
Correnti M.Profesor Agregado, Jefe del Laboratorio de Genética Molecular, Instituto de Oncología y Hematología, Ministerio de Salud y Desarrollo Social, Jefe del Centro de Biotecnología aplicada a la Odontología, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela.
Ortiz D. Instituto de Biomedicina, Ministerio de Salud, Caracas, Venezuela.
Cavazza ME. Instituto de Biomedicina. Ministerio de Salud, Caracas, Venezuela.
Avila M. Laboratorio de Genética, Instituto de Oncología y Hematología, Ministerio de Salud, Caracas, Venezuela.
RESUMEN |
INTRODUCCION
Helicobacter pylori es un importante patógeno humano que causa gastritis crónica y está asociado con el desarrollo de úlcera péptica, y gastritis atrófica. Este microorganismo es considerado como el principal factor de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico y linfomas.(1,2,3,4,5) Sin embargo, la infección solo ocurre en el 15% de las personas infectadas, siendo influenciada su aparición, por la virulencia de la especie infectante, la susceptibilidad genética del hospedero y la presencia de cofactores ambientales.(6,7)
La bacteria tiene una gran variabilidad genética, evidenciada por estudios de genotipificación y secuenciación de ADN.(8,9) Recientemente se han descrito genes bacterianos específicos que están asociados con la virulencia de las especies bacterianas.(10,11,12)
Entre los factores de virulencia bacterianos responsables de las manifestaciones clínicas, están las adhesinas (BabA, SabA), la citotoxina vacuolizante VacA, y los productos de la isla de patogenicidad Cag. Los patrones de producción de citoquinas en la respuesta a la infección por H. pylori constituyen uno de los principales factores derivados del hospedero, que pueden limitar el desarrollo de la infección a una gastritis, o favorecer el desarrollo de úlcera péptica y cáncer gástrico.
El polimorfismo de algunos genes de citoquinas (IL-1b , IL6, IL8, IL10, IL-1RN, FNT a, Interferon-ganma) han sido correlacionados con el desarrollo de úlcera péptica y adenocarcinoma asociado a H. pylori y, posiblemente estos puedan estar influenciados por la cantidad de citoquinas producidas como respuesta a la infección persistente. (13-15). Estas investigaciones concluyen que los factores de virulencia bacteriana, conjuntamente con una producción incrementada de citoquinas inflamatorias, puede ser relevante en la fisiopatología gástrica de las enfermedades producidas por H. pylori.
Aproximadamente entre un 60% a 70% de los aislados de H. pylori contiene un gen denominado cagA (gen asociado a la citotoxina), que codifica para una proteína de 128 kDa denominada CagA (16). La presencia de CagA está relacionada con la ulceración duodenal, atrofia de la mucosa gástrica y cáncer gástrico (17-18). Este gen representa una parte de una gran entidad genómica denominada isla de patogenicidad, (17) la cual contiene múltiples genes relacionados con la virulencia y patogenicidad de los aislados de H. pylori.
La presencia de CagA pude ser considerada como un marcador de la isla de patogenicidad, que está relacionada con una mayor virulencia de las cepas que la presenten (19). Algunos autores han propuesto que la presencia de este marcador está relacionada con formas más severas de enfermedad gástrica en el adulto (20). Sin embargo, otros reportes indican que una alta prevalencia del gen cagA, es encontrada independientemente del tipo de enfermedad desarrollada. (21-23).
La interacción entre la bacteria y el hospedero, es un factor clave que determina las consecuencias clínicas de la infección por H.pylori . A este respecto, el sistema immune juega un papel importante en prevenir o promover la enfermedad (24).
En el tejido de la mucosa, la IgA es la molécula predominantemente producida como dímero, la cual es transportada en vesículas endocíticas al ápice de las células epiteliales para producer el componente secretor (25). Luego, el clivaje proteolítico del componente secretor resulta en la liberación de la IgA secretora. Una asociación entre gastritis e incremento de la expresión del componente secretor ha sido reportado (26) y la infección por H. pylori también ha sido asociada con el incremento en la expresión del componente secretor por células gástricas.
El objetivo de este estudio fue evaluar los niveles de IgA secretora anti-H.pylori en la saliva de un grupo de pacientes con enfermedad de las vías digestivas superiores.
MATERIALES Y METODOS
Selección de los pacientes:
Se evaluaron 39 pacientes, provenientes del Servicio de Gastroenterología del Hospital Clínico Universitario de Caracas, Venezuela, referidos para examen endoscópico, por presentar enfermedad de las vías digestivas superiores. Como grupo control se incluyeron 20 sujetos asintomáticos. Se les presentó el consentimiento informado a cada uno de ellos y el protocolo de experimentación fue previamente aprobado por el comité de ética del FONACIT proyecto S1-96001408. A cada sujeto se le realizó una historia clínica detallada y se le pidió firmar la carta de consentimiento para participar en el protocolo. Los criterios de exclusión del presente trabajo fueron: tratamiento con antibióticos y compuestos que contuviesen bismuto u omeprazol, en las dos semanas previas al examen.
Recolección de la muestra: Se tomaron muestras de placa dental mediante raspado de las superficies supra y subgingival con cureta de Gracey, previo a la realización de la endoscopia. Igualmente se obtuvieron de cada uno de los pacientes 5 ml de saliva, y cuatro especimenes de biopsia antral, uno para el cultivo, el siguiente para la prueba de ureasa, estudio histopatológico, y el otro para la Reacción en cadena de la polimerasa (RCP).
Cultivo Microbiológico y Prueba de ureasa: Las biopsias fueron homogenizadas e inoculadas en un medio selectivo (Placas de agar Columbia, suplementadas con 7% de sangre). Las placas fueron incubadas a 37 °C en una atmósfera de 10% deCO2 por 10 días. Las colonias con una morfología sugestiva de H. pylori fueron confirmadas con coloración de Gram, y las pruebas de ureasa, catalasa y oxidasa
Detección de ADN de H. pylori de placa dental: las muestras fueron agitadas. La suspensión fue lavada con agua estéril y centrifugadas a 12000X g por 3 min. El pellet resultante fue resuspendido en 500 µl de buffer de lisis (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 25nM EDTA, 0,5% dodecilsulfato de sodio), y 10 µl de proteinasa K (10mg/ml) fue añadido. La incubación se realizó a 50ºC por 20 h; esto fue seguido por la extracción con fenol cloroformo y precipitación con etanol. El pellet resultante fue disuelto en 100 µl de buffer TE (10 mM), Tris-HCl [pH 7.4}, 0.1 mM EDTA (Etilendiaminotetracetato) [pH 8.0] por 20 h a 37º C. Las muestras fueron mantenidas a -20ºC hasta su posterior procesamiento.
Los siguientes oligonucleótidos fueron usados como primers o iniciadores: HPU 1 (5'- GCC-AAT-GGT-AAA-TTA-GTT-3'). El producto esperado después de la amplificación con estos primers era de 411 pares de bases. Una sonda interma marcada con digoxigenina HPU II (5´- ATT-GAC-ATT-GGC-GGT-AAC- 3'), fue usada para la hibridización.
La amplificación de la RCP fue realizada en un volumen de reacción total de 50 µl: 10 µl del ADN extraído y 40 µl de la mezcla de (50 µM KCl, 20 µM Tris -HCl pH 8.3, 3.0 µM de MgCl2, 0.01 de gelatina, 2.5 U de Taq polimerasa, 0.2 µM dNTPs, 0.5 µM primer HPU 1, 0.5 µM del primer HPU 2) . La denaturalización inicial fue llevada a cabo por 4 min. a 94°C.
Treinta y cinco ciclos de amplificación fueron realizados en un termociclador automático. Cada ciclo consistía de tres pasos de 1 min cada uno: un paso de desnaturalización a 94°C, un paso de anillado a 45°C, y un paso de extensión a 72°C. Los productos amplificados de la RCP fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa. Una alicuota de 15 µl (a 12 µl de cada producto amplificado, le fueron añadidos 3 µl de buffer de muestra (20 ml de glicerol 50%, 25mg de azul de bromofenol, 3 gotas de 1 N NaOH) y se realizó la electroforesis con geles preparados al 3%, los cuales fueron teñidos con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) y examinados con luz ultravioleta para observer los amplificados de ADN. Las muestras fueron consideradas positivas cuando una banda de 411 pb pudo ser observada en el gel.
Hibridización: La especificidad de los amplificados de ADN fue confirmada por hibridización con una sonda marcada con digoxigenina (HPU II; DNA Enzyme IMMUNOassay).
El plato de microtitulación fue cubierto con una sonda específica para el ensayo: Se colocaron 100 µl de la solución con la sonda biotinilada a cada pocillo. Los platos fueron incubados de 18-22 horas a 2-8°C. Al final de la incubación, los platos fueron lavados para remover cualquier exceso. Previamente al inicio de la hibridización los productos amplificados fueron desnaturalizados en un Termociclador por 15min a 94°C. Posterior al paso del lavado 100 µl de buffer de hibridización fue servido en cada pocillo (a excepción del blanco). 20 µl del amplificado desnaturalizado fue dispensado dentro de su respectivo pocillo. El plato fue lavado tres veces con 100 µl de Anti-ds-ADN- El plato fue lavado tres veces y 100 µl de Cromógeno + sustrato fueron dispensados e incubados por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Posteriormente se agregaron 200 µl de solución bloqueadora por pozo. Los platos fueron leídos a 450/360nm. La corrida fue válida cuando el radio del valor positivo de la absorbancia era mayor o igual a 10(CP /CN >10). Los controles negativos de los tubos consistían en agua destilada además del ADN de la muestra. Los controles positivos fueron examinados con cada baño del producto amplificado. Como control de la RCP se usó un cultivo de H. pylori aislado
de una muestra del antrum del estómago.
Determinación de IgA secretora anti-H.pylori en saliva: Para la determinación de IgA secretora anti-H.pylori se empleó el Ensayo enzimático ELISA estandarizado en el laboratorio: Se recolectaron las muestras directamente de cada paciente y fueron conservadas en tubos vacutainer con EDTA a20°C hasta su uso. Se empleó la técnica de ELISA usando placas de poliestireno Nunc MaxiSorp). El antígeno de H. pylori utilizado fué preparado por sonicación a partir de cultivos obtenidos de biopsias de pacientes infectados por la bacteria. Se sensibilizó la placa con 2.5 µg por pozo del antígeno diluido en buffer de cobertura a pH 9.6, durante 2 horas a 37°C. Las muestras de saliva se incubaron durante una hora a 37°C a una dilución 1/10 con PBST-BSA 0.5%. Luego se utilizó una Anti IgA marcada con peroxidasa (SIGMA) diluida 1/1000 en PBST-BSA (Buffer Fosfato Salino) 0.6% y fue incubada en una estufa a 37°C por una hora. Por último se reveló con o-fe-nilenidiamina OPD (SIGMA) y se leyó la absorbancia a 492 nm. Las lecturas de densidad óptica (DO) se realizaron a 492 nm. Las muestras de saliva se consideraron positivas cuando las DO eran iguales o mayores de 280 unidades de densidad óptica.
Análisis Estadístico
Se aplicó la prueba del Coeficiente de Similitud General de Gower para la comparación entre variables y la pruba de Kruskal Wallis que tiene una confiabilidad del 95%
RESULTADOS
Detección de H. pylori en muestras de placa dental por RCP:
H. pylori fue detectado en 24/40 (62%) de pacientes, todos con gastritis crónica.
Pacientes asintomáticos: 0.1511 +- 0.069
El grupo de pacientes sintomáticos infectados por H.pylori presentó niveles mayores estadísticamente significativos de IgA secretora-anti-H.pylori que el grupo de los pacientes asintomáticos p>0.005 (grupo control).
Distribución de pacientes positivos mediante la Reacción en cadena de la Polimerasa en biopsias de estómago y la presencia de Ig A secretora anti-H.pylori en muestras de saliva mediante el Ensayo Inmunoenzimático ELISA: Se encontró que de los 24/39 (62%) pacientes positivos para H. pylori mediante RCP en biopsias de estómago, 17/39 (44%) resultaron positivos para IgA secretora anti-H.pylori en saliva.
Por lo tanto el 71% de los pacientes positivos para la RCP en muestras de estómago resultó positiva para IgA secretora anti-H.pylori en saliva. El análisis estadístico de Gower demostró un 81% de similitud entre ambas pruebas y una especificidad del 70%.
Sensibilidad y Especificidad del Ensayo Inmunoenzimático ELISA: La sensibilidad y especificidad de este Inmunoensayo fué de 79% y 67% respectivamente.
DISCUSION
Estudios epidemiológicos han demostrado que la infección por H. pylori tiene una distribución mundial y aunque aproximadamente un 80% de los pacientes no desarrolla una enfermedad severa, un grupo de individuos puede sufrir una infección persistente convirtiéndose en crónica (27)
La prevalencia de la infección por este microorganismo, varía notablemente en todo el mundo, con una tasa del 40 al 50% en los países desarrollados y cerca del 90% en aquellos países en vías de desarrollo. El modo de transmisión de H. pylori es ampliamente discutido. (28) Aunque algunas evidencias sugieren, que esta ocurre predominantemente por contacto de persona a persona, otros autores proponen la vía fecal-oral. Recientemente se ha sido sugerido que la bacteria puede existir de forma natural en el ambiente. (29)
Numerosos estudios han reportado la asociación de H. pylori con una variedad de enfermedades gastrointestinales incluyendo gastritis crónica, úlcera péptica, y gastritis atrófica. Igualmente es considerado como el principal factor de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico y linfomas tipo Maltoma (1-4)
Las pruebas de diagnóstico para esta infección han sido clasificadas como de tipo invasivas y no invasivas, cada una de las cuales presenta una serie de ventajas y desventajas lo cual hace que sean más o menos apropiadas dependiendo de la situación clínica,
Las pruebas de tipo no invasivas obvian la necesidad del examen endoscópico, debido a que este resulta un procedimiento engorroso y de difícil aplicación, sobre todo en el diagnóstico de pacientes comprendidos en etapas tempranas y medianas de la vida (30)
Dentro de este grupo tenemos los métodos serológicos y la prueba del aliento, pruebas estas que aportan una visión global de la infección por este microorganismo, mientras que los métodos invasivos basados en la toma de la mucosa gástrica están asociados a un inherente riesgo de error de muestreo, debido a la distribución de forma irregular del microorganismo en el tejido gástrico; formando parte de este grupo encontramos el estudio histopatológico, el cultivo, la prueba de ureasa la reacción en cadena de la polimerasa, y la hibridación en placa.
En la actualidad no existe un consenso sobre cual prueba comercial o de desarrollo propio, deben ser empleadas para estudios a personas asintomáticas y en estudios de epidemiología a gran escala .(31)
Nuestros resultados mostraron la presencia de H. pylori en el 59% de los pacientes mediante cultivo microbiológico y 56% mediante la prueba de ureasa. En estudios previos realizados en Venezuela se demostró igualmente una alta prevalencia de infección por esta bacteria. (32)
Al comparar ambas pruebas, en el presente estudio se observó que 19/39 (49%) de los pacientes fueron positivos tanto para la ureasa como para el cultivo, lo cual permite establecer una relación entre ambas encontrándose una especificidad del 93% en la detección del microorganismo.Otros reportes han demostrado que la sensibilidad del cultivo varía entre un 55% a un 90% (38) La guía Europea recomienda el uso de la prueba del aliento con la urea o determinación de antígenos en heces para el diagnóstico de la infección, y la endoscopia con la histología o la prueba rápida de ureasa solo cuando esté clínicamente indicado (33).
El cultivo es un método invasivo, que consume gran cantidad de tiempo, con poca sensibilidad, y que requiere un costo elevado para el paciente, su aplicación podría mantenerse limitada a campos de investigación epidemiológicos y farmacológicos, que conduzcan a la identificación de nuevas drogas efectivas para H pylori en diferentes regiones geográficas y que permitan la obtención de una vacuna en el futuro. Desde el punto de vista clínico, el uso del cultivo es un tópico que probablemente requiera un replanteamiento y un debate profundo para asumir de forma precisa cual es su papel en la práctica clínica. (34)
También se evidenció la presencia del microorganismo en las muestras de estómago mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP), observándose en 24/39 (62%) de las muestras. Al comparar esta prueba con la de la ureasa y el cultivo microbiológico se obtuvo que 22/39 (56%), resultaron positivas también para ureasa, y 23/39 (59%) para el cultivo, mostrando una especificidad del 86% y 88% respectivamente. De estas técnicas empleadas se obtuvo mayor especificidad en las primeras que en la RCP, aún cuando esta última presentó mayor sensibilidad. Esto ha sido reportado por otros autores quienes confirman lo referido anteriormente (35)
Es importante señalar que durante el proceso de colonización, H. pylori encuentra en el microambiente gástrico, las condiciones ideales para su sobrevivencia y proliferación, las cuales son facilitadas por la presencia de la barrera de moco que rodea el epitelio gástrico, cuya función principal consiste en impedir que se produzca el contacto de las paredes gástricas con el ácido clorhídrico. Sin embargo, esta barrera es degradada por la bacteria dada su migración hacia zonas intercelulares, lugar en el cual lleva a cabo su crecimiento y proliferación, condicionando de esta forma la producción de metabolitos tóxicos, así como la activación de la respuesta inflamatoria por parte del hospedador.
Todos estos eventos generan daños ultraestructurales en el tejido gástrico pasando a ser un microambiente desfavorable para el propio organismo, limitando así su crecimiento y proliferación, lo cual podría explicar la baja prevalencia de la infección en etapas como gastritis crónica activa y cáncer gástrico, observándose en algunos casos la ausencia total del microorganismo en pacientes con gastritis crónica atrófica acompañada de metaplasia intestinal. (36)
La colonización de la mucosa gástrica por parte de las bacterias conlleva a una respuesta inmune generalizada que induce anticuerpos específicos locales y sistémicos.
La inmunidad determinada por anticuerpos en la mucosa, como respuesta inmunológica a la presencia de estas bacterias, no solo se encuentra restringida a la producción de inmunoglobulinas (Ig A) sino también a otras inmunoglobulinas que juegan un papel importante en el sistema inmunológico. (37)
Considerando la importancia de lo anteriormente expuesto, nos propusimos en el presente trabajo, evaluar la respuesta de Inmunoglobulina A secretora anti-Helicobacter pylori en la saliva de pacientes con Gastritis Crónica
Al respecto observamos que el grupo de pacientes sintomáticos infectados por H.pylori presentó niveles mayores, estadísticamente significativos de IgA secretora-anti-H.pylori , que el grupo de los pacientes asintomáticos (grupo control).
La positividad del grupo control podría explicarse basados en lo expuesto por Campuzano y col (42), quienes plantearon que a pesar que existen muchos estudios que tratan de evidenciar la presencia de H. pylori en personas sintomáticas en las que está indicada la endoscopia, las investigaciones en personas asintomáticas proporcionan un cuadro más completo de prevalencia de la infección, ya que la bacteria se aisla frecuentemente de personas asintomáticas que se consideran normales o de individuos que no tienen síntomas relacionados con dispepsia o úlcera. Asimismo estos autores refieren que las personas asintomáticas menores de 30 años de edad se encuentran infectadas por H. pylori en un 20%, edad que se corresponde con la de nuestro grupo control, que oscilaba entre 20 y 30 años de edad.
Se han realizado estudios que demuestran que el sistema immune secretor de las mucosas está involucrado en la defensa del organismo contra esta bacteria, y que una respuesta de IgAs en la mucosa gástrica anti-H.pylori puede suprimir el crecimiento de la bacteria sin la erradicación de la infección.También modelos animales han demostrado que es posible erradicar la infección por H. pylori en la mucosa gástrica mediante la administración bucal de anticuerpos monoclonales. Igualmente se ha propuesto que el incremento de la concentración local de anticuerpos específicos alcanzados a través de la vacunación oral de anticuerpos anti-H.pylori puede ser utilizada como futura terapia para prevenir la adhesion de la bacteria a las células epiteliales, aumentar la eliminación de la bacteria o interferir con otros factores asociados con la patogenicidad del microorganismo .(43)
Nuestros resultados indican que existe una correlación entre la presencia de H. pylori en la mucosa gástrica de pacientes con enfermedad de las vías digestivas superiores y la presencia de IgA secretora anti-H.pylori en saliva. Este ensayo a nivel de saliva representa una prueba rápida, no invasiva que puede ser utilizado en estudios epidemiológicos sobre todo en pacientes pediátricos.
BIBLIOGRAFIA
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