Trabajos Originales

Recibido para arbitraje: 17/01/2005
Aceptado para publicación: 21/04/2005

Ana María Rodríguez (1), Alfonso Maldonado (1), Ana María Acevedo (2).

(1)Cátedra de Materiales Dentales, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela. (2) Instituto de Investigaciones Odontológicas, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela.

Titulo Corto: Efecto de dentífricos fluorurados en la remineralización del esmalte humano
Enviar correspondencia a :
Prof. Ana María Rodríguez Centeno. Cátedra de Materiales Dentales, 7mo. Piso,Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela. Caracas,1050.A Tel. 0212-6053776
Correo electrónico: rodriana26@ hotmail.com.

INTRODUCCION
La caries dental es una de las enfermedades infecciosas de mayor complejidad y prevalencia en el hombre y constituye uno de los problemas de salud pública a nivel mundial.

La formación de la lesión inicial caries dental es el resultado neto de períodos intermitentes de desmineralización y remineralización en la cual prevalece la desmineralización(1). Por otro lado, también está ampliamente aceptado que la presencia del fluoruro en la saliva y soluciones sintéticas remineralizantes favorece la remineralización del esmalte previamente desmineralizado (2). Durante décadas se ha proporcionado considerable atención al efecto cariostático del fluoruro de sodio (NaF) y el monofluorofosfato de sodio (MFP) presentes en dentífricos (3). El fluoruro ha estado disponible por muchos años en las cremas dentales y la mayoría de los productos disponibles en los países industrializados contienen 1.100 ppm de F- (4,5,6); en Venezuela las cremas dentales fluoruradas fueron introducidas en el mercado en 1968 con una concentración de 1100 ppmF. La eficacia cariostática de los fluoruros tópicos es el resultado de dos efectos: 1) Favorecer la remineralización y 2) Inhibir la desmineralización producida por los ácidos presentes en el fluido de la placa (7,8,9).

La remineralización de lesiones iniciales de caries en el esmalte dental ocurre en forma natural in vivo (10,11) y este proceso es estimulado o favorecido por la aplicación de fluoruros tópicos como ha sido reportado ampliamente (12,13 14).

ten Cate y Duijsters (15) utilizando un modelo in vitro de pH cíclico demostraron la habilidad del fluoruro para favorecer la remineralización del esmalte, para lo cual determinaron los cambios en la dureza superficial de las lesiones iniciales de caries a través de la técnica de microradiografía, así como, la cantidad de fluoruro incorporado. Las medidas de microdureza constituyen otro método para determinar el grado de desmineralización y remineralización del esmalte dental (16,17,18). La técnica de microdureza Knoop es la más comúnmente usada para este propósito y nos provee de un método simple para obtener información de la dureza del esmalte.

Mientras los valores de microdureza no son de utilidad en determinar pequeñas diferencias en el contenido mineral y orgánico del esmalte sano, ellos constituyen un buen indicador de cambios notables en esmalte cariado (19).

El objetivo del presente estudio, fue evaluar el potencial de remineralización de dentífricos fluorurados comercialmente disponibles en Venezuela en lesiones iniciales de caries usando un modelo in vitro.


MATERIALES Y METODOS
Grupos de tratamiento:
Se utilizaron veintisiete premolares libres de caries y de defectos en el esmalte los cuales fueron extraídos por razones ortodóncicas en pacientes entre 9 y 14 años de edad. Los dientes se recolectaron durante 6 meses y se almacenaron en una solución desinfectante (Gerdex) desde su extracción hasta el momento de ser usados. Luego fueron divididos al azar en cuatro grupos, a los cuales se les aplicó el siguiente tratamiento:

Composición de los dentífricos:
El dentífrico A contenía 0,243% de NaF (1.100ppm F- total) y sílice como agente abrasivo; el dentífrico B contenía 0,076% de NaF más 0,576% de MFP (1.100 ppm F- total) y fosfato dicálcico dihidratado como agente abrasivo; el dentífrico C contenía 0,10% de NaF más 0,76% de MFP (1.450 ppm F- total) y también fosfato dicálcico dihidratado como abrasivo; El dentífrico D contenía fosfato dicálcico dihidratado como agente abrasivo, sin fluoruro, y fue utilizado como control.

Todos los dentífricos fueron empacados en tubos de 3-oz y codificados con letras antes de ser entregados a los investigadores. La identificación de cada dentífrico se realizó una vez culminados los análisis de remineralización.

Preparación de las mezclas de dentífricos:
Las mezclas de dentífricos fueron preparadas cada día con agua deionizada al 50% (p/v), se llevaron a un agitador magnético (350 rpm) hasta obtener una mezcla homogénea. Durante el periodo de tratamiento, los especimenes se mantuvieron sumergidos en la mezcla bajo agitación para simular el cepillado dental.

Recolección de la saliva:
Se utilizó una mezcla de saliva humana como medio remineralizante en todos los regímenes de tratamiento. Se recolectó diariamente saliva fresca por estimulación con parafina de cinco voluntarios, los cuales se mantuvieron en ayuno durante 12 horas (la misma cantidad cada día de cada individuo). Durante el proceso de recolección, la saliva se mantuvo en hielo y una vez finalizada, las muestras se colocaron a 4ºC hasta el momento de la preparación de la mezcla. Posteriormente, las muestras fueron mezcladas y agitadas vigorosamente, hasta obtener una solución homogénea, y alicuotada (20ml) en vasos de precipitado de 50ml.

Preparación de los especimenes:
Las coronas de los dientes incluidos en el estudio fueron lavadas con solución detergente, enjuagadas con agua destilada y secadas con aire. Luego las coronas fueron separadas de las raíces usando un disco de carborundum y montadas en cilindros metálicos (2.0 cm de alto por 3.0 cm de diámetro) utilizando resina acrílica como medio de unión, de manera que la superficie bucal estuviera expuesta. El esmalte expuesto se desgastó usando papel de lija Nº 600 montado en una pulidora metalográfica (Buehler LTDa Metallurgical apparatus) a una presión manual constante por 10 segundos hasta obtener una superficie plana y paralela. Los especimenes luego se pulieron con gamma alúmina con un tamaño de grano de 1,0 y 0,05 m usando lienzos y nylon. Este tratamiento también permitió la eliminación de la porción externa del esmalte rica en fluoruros 20. Finalmente, los bloques de acrílico con los especimenes fueron suspendidos en las soluciones de tratamiento (saliva o solución de ácido láctico).

Preparación de la lesión inicial:
Las lesiones iniciales de caries dental fueron preparadas antes de iniciarse el estudio; éstas se realizaron usando el sistema buffer lactato-hidroxiapatita convencional descrito por White y col 21. Cada espécimen fue sumergido individualmente en 40 ml de una solución de ácido láctico 0,1 M (pH 5.0), carboximetilcelulosa al 0.2% e hidroxiapatita (HAP) saturada al 50% por 72 horas para producir la lesión de caries artificial de aproximadamente 120 m de profundidad, con una capa superficial intacta de 20 m, como fue descrito por ten Cate y Duijsters 15. Después de la preparación de la lesión, se calculó el número de microdureza Knoop (KHN) pre-tratamiento para cada espécimen como el promedio de seis indentaciones.

Régimen de tratamiento:
Se utilizó el sistema de pH cíclico descrito por ten Cate y Duijsters 15 el cual se realizó durante cinco días. El régimen de tratamiento consistió de cinco horas por día de desmineralización con una solución de ácido láctico 0,1 M, pH 5.0, y cuatro exposiciones de 1 minuto en la solución del dentífrico en evaluación; el tiempo remanente (aproximadamente 19 horas) involucró remineralización con saliva. Previo al inicio del tratamiento experimental, los especimenes se sumergieron en 20 ml de la mezcla de saliva por 30 minutos, para promover la formación de la película adquirida. Una vez realizado el pre-tratamiento con saliva, para el tratamiento experimental, los especimenes se colocaron primeramente en 20 ml de la mezcla de los dentífricos (50% p/v) por 60 segundos bajo agitación constante, luego fueron enjuagados con agua destilada, hasta remover todo el dentífrico residual de la superficie del esmalte, y posteriormente colocados nuevamente en 20ml de saliva bajo agitación constante. Los tratamientos con dentífricos y saliva se alternaron varias veces cada día (6 veces en saliva y 4 veces en la mezcla de dentífrico) durante el período de tratamiento; además de las 5 horas de exposición a la solución desmineralizante.

Medida de la Microdureza Knoop:
Los cambios en la microdureza del esmalte para cada diente fueron determinados por la diferencia entre la microdureza inicial del esmalte sano y la microdureza del esmalte para cada espécimen tratado y sin tratar. Las medidas fueron realizadas usando un microdurómetro (Tukon Micrihardness Tester model MO) con 200 g de tensión, de acuerdo al método descrito por Purdell y col. 22. Cada análisis consistió de una serie de seis medidas realizadas en la superficie del esmalte de cada espécimen. Cuando se realizaron las medidas de dureza post-tratamiento se trató en lo posible de que las indentaciones estuvieran lo más cercanas posibles a las realizadas en el esmalte sano.


RESULTADOS
Se determinaron los valores individuales de microdureza para esmalte sano, desmineralizado y remineralizado y la diferencia entre los valores de KHN después del tratamiento de desmineralización y remineralización (REM-DEM) (tablas 1 a 4). Estos resultados sugieren que aunque se notaron algunas variaciones en los valores de dureza individual entre los diferentes dientes, no se observaron diferencias significativas cuando se compararon estadísticamente los valores promedios para cada grupo. Se observó una disminución en los valores de microdureza después del tratamiento con ácido (desmineralización) en todos los grupos, seguido por un incremento después de los tratamientos (remineralización) con los tres dentífricos fluorurados utilizados en este estudio.

Los valores REM-DEM se utilizaron para la evaluación estadística con la cual se determinó la eficacia de los dentífricos fluorurados (A, B y C). Las pruebas de Cochran y Bartlett se usaron para verificar la homogeneidad de la varianza de los grupos que fueron comparados. Los resultados fueron los siguientes:

Estos resultados indicaron diferencias en la varianza entre los grupos, mostrando que las muestras no fueron homogéneas, por lo tanto la prueba ANOVA no podía ser usada para el análisis de los datos.

Basados en estos resultados, se decidió analizar cada grupo individualmente de forma de determinar cuál de los grupos era el causante de las diferencias en la varianza y para este análisis se usaron las pruebas de Box y Wisker Plot, Stem y Leaf Display y Summary statistics. Los resultados demostraron una alta varianza en el Grupo 2 (Dentífrico A), detectándose claramente dos grupos dentro del mismo grupo: (i) con alta remineralización y (ii) con baja remineralización. En vista de estos resultados, se decidió dividir este grupo en dos, para propósitos de análisis estadístico; (i) Grupo 2 Dentífrico A (baja remineralización [baja-rem]) y (ii) Grupo 3 Dentífrico A (alta remineralización [alta-rem] ).

Para llevar a cabo una nueva comparación de los grupos, fue necesario cambiar los grupos originales (ver Materiales y Métodos; Tratamiento de los grupos*) como se expresa a continuación:

Estos nuevos grupos fueron re-analizados para verificar la homogeneidad de las varianzas utilizando la misma prueba estadística que en el análisis original. Los resultados fueron los siguientes:

Estos resultados indican que la varianza entre los nuevos grupos fue homogénea. De esta forma la prueba de análisis de la varianza (ANOVA) pudo ser usada para comparar los grupos. Los resultados de esta prueba muestran una alta diferencia estadística entre los grupos estudiados (F = 15,317) a un valor de p = 0.001. La prueba de Significancia Mínima (LST) se utilizó para medir diferencias entre los dentífricos. Los valores promedios de KHN, de REM-DEM y las tendencias estadísticas son presentadas para cada grupo (Tablas 5 y 6).

El grupo 3 (sub-grupo con alta remineralización), el cual fue tratado con el Dentífrico A que contenía 0,243% NaF (1.100 ppm F) mostró el más alto valor promedio de REM-DEM (44,5) seguido por el grupo 4 (33,4) el cual fue tratado con el Dentífrico C que contenía 0,10% NaF y =0,76% MFP (1.450 ppm F) (tabla 5).

Es interesante notar que el grupo 2 (sub-grupo con baja remineralización, que también fue tratado con el Dentífrico A mostró el más bajo valor de REM-DEM (15,8), y fue comparable a los obtenidos para el grupo control (8,4) y grupo 5 (19,0) los cuales fueron tratados respectivamente. con el Dentífrico D (sin fluoruro) y con el Dentífrico B que contenía 0,576% MFP más 0,076% NaF,

Se observó una gran variabilidad en los valores de microdureza Knoop (KHN) cuando el grupo tratado con el Dentífrico A fue analizado como un todo (Tabla 2). Esta variación no fue observada en los otros grupos, los cuales demostraron resultados más homogéneos. (Tablas 1, 3 y 4).

Los análisis estadísticos (Tabla 6) demostraron valores de REM-DEM altamente significativos para el Dentífrico A/alta-rem (Grupo 3), Dentífrico C (Grupo 4) y Dentífrico B (Grupo 5 ) cuando fueron comparados con el control (Grupo 1) todos a p<0,001. También fueron evidentes valores de REM-DEM altamente significativos cuando se compararon el Dentífrico A/alta -rem (Grupo 3) contra el Dentífrico B (Grupo 5) (p<0,001) y al comparar el Dentífrico C (Grupo 4) contra el Dentífrico B (Grupo 5) (p<0,001) y contra el Dentífrico A/baja-rem (Grupo 2) (p<0001).

No se observaron diferencias significativas entre el Dentífrico A/baja-rem (Grupo 2) y el control (Grupo 1); entre el Dentífrico B (Grupo 5) y el Dentífrico A/baja-rem (grupo 2); entre el Dentífrico C (Grupo 4) y el Dentífrico A/alta-rem (Grupo 3) (Tabla 6). Estas comparaciones estadísticas sugieren que bajo este protocolo experimental, los Dentífricos C y A (sub-grupo de alta remineralización) fueron los más eficaces en promover la recuperación de la microdureza del esmalte.

Utilizando el mismo análisis y protocolo, también se observaron valores de remineralización altamente significativos entre el dentífrico C (Grupo 4) y B (Grupo 5) (p<0,001), lo que sugiere que el Dentífrico C produjo una mayor eficacia en remineralización que el dentífrico B, otra formulación idéntica NaF/MFP pero a más baja concentración (76% menos que el Dentífrico C para ambos componentes aproximadamente).


DISCUSION
El modelo cíclico de pH utilizado en esta investigación permite la formación de una capa proteica (película adquirida), así como la formación de placa dental, ya que éste incluye una etapa de pre-tratamiento y tratamiento remineralizante con saliva humana fresca, la cual contiene las bacterias necesarias para la formación de la biopelícula. Por lo tanto, las condiciones experimentales simulan en gran parte lo que podría suceder el la cavidad bucal.

La técnica de microdureza superficial se utilizó en este estudio como método analítico, ya que constituye una forma sencilla, científica, cuantitativa y precisa para determinar el grado de desmineralización y remineralización del esmalte dental (16,22,17,18). Algunos autores han demostrado que los valores de microdureza están relacionados con el contenido mineral del esmalte sano (23,24,25,19). Otros (26,27,17) han reportado que en lesiones de caries producidas artificialmente en esmalte humano tratado con ácido, la microdureza disminuye con un descenso en el contenido mineral del tejido y consecuentemente se produce un incremento en la longitud de la indentación Knoop.

Con respecto a valores KHN reportados para el esmalte sano por Gelhard y Arends (18)(316-334), Featherstone y col (28)(280-350) y Reistema y Arends (29)(314), los valores promedios de microdureza encontrados en los dientes utilizados en este estudio (Tabla 6), estuvieron por debajo de los reportados por los autores antes mencionados. La microdureza del esmalte está relacionada directamente con su contenido mineral (23,24,25,19) por lo que podría interpretarse que el contenido mineral del esmalte en esos dientes es más bajo. Una posible explicación para este hallazgo sería una mineralización incompleta del esmalte, ya que estos dientes fueron obtenidos de niños entre 9 y 14 años, un rango de edad dentro del cual el proceso de mineralización no se ha completado. Adicionalmente, podría considerarse el tiempo de almacenaje en Gerdex como otra variable determinante de la perdida mineral en el esmalte de los dientes evaluados; ya que todos los minerales tiene un cierto grado de solubilidad a una temperatura determinada en soluciones acuosas, el cual es inherente a cada tipo de mineral. La disolución de los minerales en agua es relativamente rápida y disminuye a medida que se alcanza el equilibrio de la solución(30). Por lo tanto, la comparación de la dureza Knoop reportada en esta investigación con la obtenida por Gelhard y Arends (18), Featherstone y col (28) y Reistema y Arends (29), ( en sus condiciones experimentales), podría no ser adecuada. Sin embargo, es importante resaltar que las diferencias de los valores iniciales de microdureza Knoop de los dientes analizados en esta investigación no fueron diferentes estadísticamente por lo que se consideró una muestra homogénea.

La habilidad de la saliva para favorecer el proceso de remineralización, fue confirmada en esta investigación, la cual intentó simular un proceso que en forma natural ocurre en la cavidad bucal. Los resultados indicaron un cierto grado de remineralización en el esmalte superficial previamente desmineralizado, de los dientes incluidos en el grupo control. Esto podría explicarse en una parte por la capacidad remineralizante natural de la saliva humana de alguna forma incrementada por la presencia de ciertas cantidades de fluoruro proveniente de otras fuentes, tales como agua, alimentos etc, y por otra parte, la presencia en la formulación control de sales de fosfato de calcio, como abrasivo, la cual podría constituirse en una fuente de calcio y fosfato que de alguna manera favoreció la capacidad reminaralizante de dicho dentífrico.

Algunos estudios in vitro han demostrado la remineralización de lesiones de esmalte producidas artificialmente (31,32,33). Los resultados de la presente investigación claramente demostraron que la presencia de fluoruro en diferentes concentraciones en los dentífricos promueve el proceso de remineralización, Una remineralización significativamente alta (p<0,001) fue evidente en los dientes tratados con el dentífrico C que contenía 0,10% NaF y 0,76% MFP (1,450 ppm F), comparados con el grupo de dientes tratados con el dentífrico B, con la misma formulación pero en diferente concentración. 0,076% NaF y 0,576% MFP (1.100 ppm F). Estos resultaos confirman otros reportes (34,35,36,37,38) que indican que un incremento en el contenido de fluoruro en los dentífricos incrementa su capacidad remineralizante.

Al comparar dos dentífricos con diferente formulación pero con una concentración final de fluoruro similar, se pudo observar que el uso de un dentífrico con NaF solo (Dentífrico A, alta-rem, 1.100 ppm F) produjo un valor REM-DEM significativamente más alto (p<0,001) que la observada con una formulación diferente pero con una concentración de fluoruro similar, (Dentífrico B, NaF-MFP, 1.100 ppmF) (Tablas 5 y 6). Además, cuando el Dentífrico A (alta-rem; 1.100 ppmF) fue comparado al Dentífrico C el cual contenía 0,10% NaF más 0,76% MFP (1.450 ppmF), no se observaron diferencias significativas en la incorporación mineral. Sin embargo en términos de valores REM-DEM, el Dentífrico A (alta-rem) mostró valores REM-DEM numéricamente más altos (Tabla 5).

De acuerdo a estos resultados, un dentífrico con NaF parece ser relativamente más eficaz en remineralizar in vitro, que un dentífrico con una combinación de NaF y MFP. Resultados similares han sido reportados por otros autores 6,39,40. Esto podría sustentarse en el hecho de que aunque los niveles de fluoruro total en las dos formulaciones fueron los mismos, el fluoruro iónico total disponible para la remineralización en los dos experimentos fue diferente. En el caso del dentífrico que contiene 0,243% NaF (dentífrico A/alta rem), el fluoruro total disponible fue de 1100ppmF, debido a que esta molécula se disocia espontáneamente en solución acuosa y genera fluoruro libre disponible totalmente para el proceso de remineralización. Por el contrario, el dentífrico con la mezcla NaF+MFP (dentífrico B) contiene 0,076% NaF y 0,576% MFP, obviamente, en este caso la cantidad de fluoruro total disponible a partir del NaF es 3.2 veces menor al comparado con el dentífrico A/alta rem, por lo que es evidente que la cantidad de fluoruro total disponible proveniente del NaF es mucho menor. Sin embargo, se calculó que la diferencia en la concentración total de fluoruro en el dentífricos que posee la mezcla debería obtenerse a partir de la hidrólisis del ion MFP; lo cual en nuestras condiciones experimentales dependería en gran parte de la concentración y actividad de las enzimas hidrolasas (fosfatasas) presentes en la saliva utilizada durante el periodo experimental. Los productos finales de la hidrólisis del ion MFP por acción de las fosfatasas resultarían en una mezcla de fluoruro, fosfato y MFP en concentraciones inferiores a las calculadas, por lo que la concentración final total de fluoruro en la mezcla del dentífrico B sería inferior a la del dentífrico A/alta rem y por lo tanto su efectividad debería ser menor como se demuestra en esta investigación.

Esta explicación se confirma cuando comparamos el dentífrico A (alta-rem, 1.100 ppmF a partir de NaF) con el dentífrico C (1450 ppmF a partir de la mezcla NaF+MFP,) donde se esperarían diferencias significativas en los valores DEM-REM, debido a la mayor concentración de fluoruro presente en el dentífrico C, sin embargo, la diferencia entre los valores observados fueron no significativas desde el punto de vista estadístico. De esta forma se espera que el tratamiento de una lesión de caries con un dentífrico que contenga más flúor iónico disponible, en este caso el que contenía NaF, podría ser más efectivo como agente remineralizante.

Particularmente notable, es la diferencia estadísticamente significativa (p<0.001) en los valores REM-DEM entre el Dentífrico B y C ambos con NaF/MFP, pero a diferentes concentraciones de fluoruro (Tabla 6). El incremento de la concentración de ambos componente aproximadamente en un 32%, manteniendo la misma relación NaF/MFP, produjo altos valores de remineralización; lo que significa que al haber mayor biodisponibilidad de fluoruro en la formulación, su efectividad va a se incrementarse, lo cual reconfirma lo anteriormente expuesto.

Una alta Varianza también fue observada en los resultados de los grupos tratados con el Dentífrico A, el cual contenía NaF a 1.100 ppm F. Esta variación no fue observada con los otros dentífricos, en los cuales los valores fueron más homogéneos. El pequeño tamaño de la muestra puede haber contribuido a este fenómeno, en tales tamaños de muestras generalmente hay un alto riesgo de sesgo debido a variaciones individuales de los especimenes. La gran variación observada en el Grupo 2 (Dentífrico A), puede deberse al hecho de haber incluido en dicho grupo, dientes con esmalte cuya capacidad de desmineralización/remineralización estaba comprometida o era de un orden más bajo, antes de ser seleccionados para el estudio, como se corrobora en el grupo 1 donde el espécimen con menor valor inicial de microdureza mostró la menor capacidad remineralizante. Sin embargo, tal hipótesis no explica lo observado en el Grupo 3, en el cual dos de los especimenes con los valores más bajos de microdureza inicial, presentaron una remineralización sustancial, acercándose al valor REM-DEM promedio del grupo.

En vista de tales inexplicables variaciones entre los miembros de una población, pero que resulto básicamente homogénea desde el punto de vista estadístico, será necesario probablemente llevar a cabo estudios con muestras de mayor tamaño para explicar en una forma más precisa las variaciones ocurridas.

Basándonos en nuestros resultados la concentración de fluoruro en la formulación es determinante para incrementar la capacidad remineralizante de un dentífrico, como se demostró, siendo los Dentífrico A/alta-rem y Dentífrico C los más eficaces desde el punto de vista estadístico.


Agradecimientos:
Los autores quieren mostrar su agradecimiento a la señora Mariela Soto de Luna y a la Lic. Yanira Infante por su colaboración en el desarrollo de esta investigación, así como a los voluntarios que donaron las muestras de saliva, sin cuya colaboración no hubiera sido posible llevarla a cabo.