Trabajos Originales

Recibido para arbitraje: 19/07/2004
Aceptado para publicación: 19/07/2004

• Ruthinéia Diógenes Alves Uchôa LINS Doctora en Patología Oral / UFRN y Profesora Titular de la Disciplina de Periodóncia / UEPB
  
  
• Claúdia Roberta Leite Vieira de FIGUEIREDO Profesora Doctora de la Disciplina de Patología General / UFPB
  
  
• Gustavo Pina GODOY Alumno de doctorado en Patología Oral / UFRN
  
  
• Ericka Janine Dantas da SILVEIRA Alumno de doctorado en Patología Oral / UFRN
  
  
• Manuel Antonio GORDÓN-NÚÑEZ Alumno de doctorado en Patología Oral / UFRN Roseana de Almeida FREITAS Profesora Doctora del Programa de Post Grado en Patología Oral / UFRN
  
  Dirección para correspondencia
  Roseana de Almeida Freitas. Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
  Departamento de Odontologia. Programa de Pos-Graduação em Patologia Oral
  Av. Senador Salgado Filho, 1787 - Lagoa Nova CEP: 5905600 Natal - RN
  Teléfono/Fax: (55)(84)215-4138 e-mail: [email protected]

Introducción
El sistema de defensa del hospedero desempeña una función especial en la patogénesis de la enfermedad periodontal, pues además de modular los efectos bacterianos, contribuye efectivamente con el proceso de la enfermedad (1, 2, 3, 4, 5).

Contrastando con el gran numero de bacterias presentes en el interior del surco gingival, pocas son encontradas bajo el epitelio, ésta reducción, probablemente, resulte de la combinación de factores tales como la barrera física proporcionada por el propio epitelio y las respuestas protectoras del hospedero, representadas por los factores humorales (anticuerpo y complemento) y fagocitos humanos (2, 3, 4).

Existen evidencia que demuestran la importancia de los neutrófilos y macrófagos en la defensa local del área dento gingival contra microorganismos periodontopatógenos (3). Tambiém se han observado neutrófilos en pocas cantidades en el surco gingival de la encía clínicamente sana (4,5). Sin embrago, con la proliferación bacteriana en el área dento gingival, un número creciente de neutrófilos, provenientes del interior de los vasos sanguíneos presentes en el tejido conectivo adyacente, migran por ese tejido, atraviesan el epitelio del surco gingival y lo invaden, donde entran en contacto directo con la microbiota del biopelícula subgingival, representando así, la primera línea de defensa celular del organismo hospedero en el control bacteriano (6, 7, 8, 9).

Los neutrófilos poseen un tiempo corto de vida media (48 a 72 horas) y si durante ese tiempo, no son suficientemente eficaces en el control bacteriano, luego comienzan a ser substituidos por los monocitos / macrófagos, los cuales representan la segunda línea de defensa celular (8, 10). En cualquier condición inflamatoria donde ocurre pérdida tisular, existe reclutamiento de monocitos / macrófagos, ya que éstas células poseen la capacidad de fagocitar restos necróticos y secretar citoquinas inflamatorias y reparadoras (2, 11).

En condiciones normales los macrófagos reclutados en el tejido conectivo digieren el antígeno completamente e inician el proceso de reparo a través de la liberación de factores de crecimiento y citoquinas anabólicas (8, 9, 12, 13). Sin embargo, cuando se compara el número de bacterias presentes en la placa subgingival de pacientes con enfermedad periodontal en relación con el número de bacterias presentes en pacientes con encía sana, se observa un incremento notable en la cantidad de estas en los pacientes con periodontopatía. Esa pesada carga antigénica puede suplantar el sistema inmunológico innato, destorciendo ó evitando cualquier efecto protector aparente (4, 7).

En la mayoría de las circunstancias, la activación de fagocitos y componentes del complemento, permite la eliminación del antígeno, promoviendo así, la resolución del proceso inflamatorio. Sin embargo, sí ese antígeno es encontrado en grandes cantidades, es posible que su digestión sea difícil con la subsiguiente activación de la respuesta inmunológica específica ó adaptada, que tiene como principales representantes celulares a los monocitos y linfocitos, los cuales interactúan entre sí tanto directamente ó por medio de citoquinas (2, 3, 12, 14).

Algunos autores (8, 12, 15, 17) relatan que histológicamente, en los estadios iniciales de la enfermedad periodontal, se observa un infiltrado inflamatorio discreto, representado por neutrófilos, macrófagos y ocasionales linfocitos, los cuales se acumulan en el tejido conectivo gingival adyacente al epitelio del surco. Sin embargo, a medida que la enfermedad periodontal progresa, ese infiltrado se torna más acentuado, presentando un aumento del número de linfocitos y plasmocitos, asociado a un número decreciente de neutrófilos.

Tomando en consideración la importante participación de los macrófagos tanto en la respuesta inmunológica innata como en la adaptada, así como la importancia de su presencia en los diferentes estadios de la enfermedad periodontal, el objetivo de esta investigación fue analizar comparativamente el patrón de distribución macrofágica y la densidad de marcación inmunohistoquímica de essas células en casos de gingivitis y periodontitis crónica, a fin de obtener datos que puedan contribuir con la comprensión del papel relevante de la respuesta inmunológica en la etiopatogenia de la enfermedad periodontal.


Materiales y métodos
Muestra:
Fueron utilizados en total 42 especimenes de tejidos parafinados, diagnosticados clínicamente como gingivitis crónica (17 casos) y periodontitis crónica (25 casos), pertenecientes al archivo del Servicio de Anatomía Patológica de la Sección de Patología Bucal del Departamento de Odontología de la Universidad Federal do Rio Grande do Norte -UFRN - Brasil. Estos especimenes fueron obtenidos a partir de procedimientos quirúrgicos realizados con finalidad estética y curativa en un consultorio particular y en clínicas de periodoncia y cirugía oral del departamento antes mencionado.

Éste estudio fue debidamente analizado y aprobado por el Comité de Ética en la Investigación de la UFRN, los especimenes fueron cedidos por los pacientes mediante la firma de un documento libre de consentimiento informado.

Estudio inmunohistoquímico:
A partir de cada una de las muestras tomadas se obtuvieron cortes histológicos de 3 micrómetros de espesor, los cuales fueron extendidos en láminas de vidrio preparadas con adhesivo a base de 3-aminopropyltrietoxy-silano (Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). Posteriormente, los cortes fueron sometidos a la técnica de inmunohistoquímica, por el método de la estreptavidina biotina (SABC), utilizando el anticuerpo primario anti-CD68, cuyas características referentes a especificidad, clon, tratamiento de recuperación antigénica, dilución y tiempo de incubación se encuentran registrados en el cuadro 1.

Método de análisis de las células inmunomarcadas:
Para la evaluación de la densidad de inmuno marcación celular en la lámina propia de los especimenes tejiduales se establecieron valores que oscilaban entre 0 y 3, de acuerdo a la metodología descrita por Mega, Jiang y Takagi 19 adaptada para éste estudio, obedeciendo los siguientes parámetros: valor 0 - ausencia de células positivas; valor 1 - número reducido de células positivas; valor 2 -número moderado de células positivas y valor 3 -número elevado de células positivas. Fue realizado también un análisis descriptivo de los hallazgos microscópicos referentes a localización (yuxtaepitelial y/o distante del epitelio) y patrón de distribución (focal y/o difusa) de las células CD68 positivas en el tejido conectivo gingival.

Análisis estadístico:
Para la variable dependiente de tipo cuantitativa ordinal (densidad de células CD 68+), considerando la ausencia de normalidad de los datos verificada por el test de Kolmogrov y la propia característica de la variable, se optó por un análisis no paramétrico a través del test de Mann-Whitney.


Resultados
Gingivitis crónica:
Todos los casos examinados fueron inmuno reactivos al anticuerpo anti-CD68, las células CD68+ se distribuyeron de forma difusa en 100% de la muestra, localizándose predominantemente en posición yuxtaepitelial (Figuras 1 y 2). De ese total, 7 especimenes (41,2%) también presentaron inmuno marcación en áreas distantes del epitelio (Figura 1).

El valor 2, referente a la densidad de marcación celular para el anticuerpo antí-CD68, fue predominante en más de la mitad de la muestra (10 casos) seguido por los valores 1, observado en 5 casos y valor 3 encontrado en sólo 2 especimenes (Tabla 1).

Periodontitis crónica:
La muestra total reveló marcación positiva para el anticuerpo anti-CD68. Las células inmuno marcadas mostraron un patrón de distribución celular difuso próximo al epitelio (Figura 3) en todos los especimenes evaluados (100%), si embrago 15 (60%) de los 25 casos también exhibieron inmuno positividad a distancia (Figuras 3 y 4). La mayoría de la muestra (18 especimenes - 72%) presentó valor 1 de densidad de marcación celular para el anticuerpo anti-CD68. Sólo 7 casos presentaron valor 2 (Tabla 1).

La presencia de células CD68+ en la camada basal del epitelio, constituyó un hallazgo frecuente tanto en la gingivitis, así como en la periodontitis, especialmente en los casos donde hubo marcación CD68+ yuxtaepitelial. A veces, también fueron encontradas células CD68+ dentro de vasos sanguíneos en la lámina propia.

Gran cantidad de linfocitos y plasmocitos estaban presentes en la lámina propia de los especimenes tisulares evaluados, sin embargo, los neutrófilos fueron observados ocasionalmente.

Resultados del análisis estadístico:
La densidad de células CD68 + osciló entre 1,0 y 3,0 con mediana igual a 2,0 en la gingivitis crónica y entre 1, 0 y 2,0 con mediana de 1,0 en la periodontitis crónica. Tales datos se encuentran ilustrados en la Tabla 2 y en la Figura 5.

Las tablas 2, 3 y la figura 5 expresan los resultados de la estadística descriptiva e inferencial de la comparación entre los grupos estudiados, cuando se consideran las variables cualitativas ordinales (categóricas), susceptibles por lo tanto de un análisis no paramétrico, la cual reveló una diferencia significativa (p< 0,05) en la densidad de células CD68+ entre los grupos estudiados, siendo tal densidad mayor en la gingivitis que en la periodontitis crónica.

Discusión
Se ha demostrado que las biopelículas dentales en pequeñas cantidades puede mantenerse en el hospedero sin causar enfermedad periodontal, probablemente como resultado de los mecanismos de defensa del hospedero. Sin embargo, cuando las bacterias periodontopatogénicas, presentes en el interior de la biopelícula subgingival aumentan significativamente, poseen factores de virulencia y asociado a ello, la capacidad defensiva del hospedero es deficiente, se altera el equilibrio ecológico del microambiente del surco gingival, dando por lo tanto lugar al desarrollo de la enfermedad periodontal (2,4,9,16,17). Histopatológicamente, la enfermedad periodontal se caracteriza por la infiltración de células inflamatorias en los tejidos periodontales, y en el surco gingival como un intento de controlar el proceso infeccioso (3, 8, 16, 17).

En éste estudio, la inflamación evidenciada en toda la muestra se presentó de forma intensa en 94,1% de los casos de gingivitis crónica y en 88% de los casos de periodontitis crónica. Tales datos caracterizan una acentuada participación de la respuesta inmunológica frente a la agresión bacteriana en la enfermedad periodontal, representando un reflejo del aumento cualitativo de las bacterias periodontopatogénicas en el interior de la biopelícula dental (4, 9,18).

El factor transformante de crecimiento b (TGF-b), además de ejercer un potente efecto quimiostatico sobre las células inflamatorias, especialmente en los neutrófilos y macrófagos, también facilita la adhesión leucocitaria a la pared vascular y a los componentes de la matriz extracelular, induciendo el aumento de la expresión de adesinas e integrinas leucocíticas, favoreciendo con eso el reclutamiento de las células inflamatorias hacia el sítio de la enfermedad (19).

La ausencia relativa de neutrófilos en la lámina propia de los especimenes de gingivitis y periodontitis crónicas evaluados puede ser explicada por el hecho de poseer esas células un tiempo corto de vida media, siendo posteriormente substituidas por los monocitos reclutados de la sangre, los cuales, se diferencían en macrófagos y pasan a asumir la función de fagocitosis antes realizada sólo por los neutrófilos (20). La substitución de los neutrófilos por los macrófagos en el lugar de la inflamación, representa una etapa normal de todo proceso inflamatorio, ya que éstas células constituyen la primera y la segunda línea de defensa celular del hospedero (3, 8, 12).

Los monocitos y los neutrófilos también salen del interior de los vasos sanguíneos hacia el ambiente extra vascular, donde se diferencían en macrófagos como respuesta a la atracción ejercida por agentes quimiotácticos, tales como, el componente C_5a del sistema de complemento, factores bacterianos, leucotrienos B₄, citoquinas, productos de los neutrófilos, fibrinopeptídeos, fragmentos de colágeno y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (3,12).

Se sabe que los macrófagos representan cerca de 5 a 30 % del infiltrado inflamatorio presente en las lesiones periodontales (23). Tales células participan no solo en la respuesta inmunológica inespecífica, fagocitando microorganismos y secretando citoquinas inflamatorias (22,23), sino en la respuesta inmunológica específica, donde actúan, principalmente, como células presentadoras de antígeno (APCs) (12, 26). Las APCs fagocitan el antígeno y lo expresan en su superficie asociado a la molécula de histocompatibilidad clase II (MHC-II) para así presentarlo al linfocito T colaborador, activando la respuesta inmune T-dependente (12, 24, 25, 26).

Se sugiere que la expresión contínua de interferón - γ (IFN-γ) y la ausencia de secreción de la interleuquina - 4 (IL-4) por los linfocitos T colaboradores parecen ser responsables por la concentración y activación de macrófagos en la enfermedad periodontal, ya que la primera citoquina potencializa la función macrofágica y la segunda actúa como un supresor celular (18).

En un estudio realizado por Socransky et al. (1998), se pudo constatar una falla aparente en el reclutamiento y en la activación macrofágica en la enfermedad periodontal avanzada, dado que los marcadores de activación celular de los macrófagos (Factor de crecimiento de fibroblastos básico - bFGF) se mostraban poco evidentes en los especímenes de periodontitis crónica evaluados y el número, así como el patrón de distribución de esas células en los mencionados especimenes fueron similares a aquellos encontrados en los tejidos gingivales clínicamente sanos; no siendo observadas diferencias en la activación, cantidad y patrón de distribución de los macrófagos entre el estado gingival saludable y la enfermedad periodontal, permaneciendo reducido el número de esas células en ambas condiciones.

Con el objetivo de evaluar comparativamente el patrón de distribución y la densidad de macrófagos en las diferentes etapas de la enfermedad periodontal, el presente trabajo se propuso realizar un análisis inmunohistoquímico de esas células, llevando en consideración la dificultad de visualización de las mismas en el estudio morfológico. Aunque los macrófagos puedan ser evidenciados a través de microscopia electrónica y en cortes histológicos teñidos por la técnica de la hematoxilina / eosina analizados en microscopia óptica, su presencia es identificada más fácilmente utilizando el marcador inmunohistoquímico CD68 (28, 29, 30, 31). por esa razón, para la identificación de los macrófagos en los especimenes gingivales de éste estudio se optó por la utilización del mencionado anticuerpo que, según algunos autores (32), reconoce epitopos en gránulos lisosomicos presentes en el citoplasma de histiocitos y macrófagos.

El análisis cuantitativo del patrón de expresión de las células CD68+ en la lámina propia de los especimenes de gingivitis y periodontitis crónica examinados reveló la presencia de esas células distribuidas de forma difusa, estando localizadas preferencialmente en posición yuxtaepitelial en 100% de la muestra. Un 41,2% de los casos de gingivitis crónica y 60% de los de periodontitis crónica también exhibieron inmuno marcación distante del epitelio. Constituyó un hallazgo frecuente la presencia de células CD68+ en la capa basal del epitelio, tanto de la gingivitis, como de la periodontitis crónica, especialmente en los casos donde hubo marcación CD68+ dentro de vasos sanguíneos en la lámina propia.

Basados en los datos antes mencionados y según la literatura consultada, es posible sugerir que la posición yuxtaepitelial de las células CD68+ está asociada íntimamente al hecho de que esas células constituyen una especie de barrera subepitelial que intenta realizar la fagocitosis bacteriana, así como la adaptación y el procesamiento antigénico, ya que, además de la fagocitosis, tales células también son presentadoras de antígeno (APCs), buscando, a través de esos mecanismos, impedir la invasión bacteriana en el tejido conectivo gingival y/ó destruir las bacterias invasoras.

De forma similar, la localización de las células CD68+ distantes del epitelio parece representar la migración de esas células para los linfonodos regionales con el objetivo de realizar la presentación antigénica a los linfocitos T colaboradores. Las células antes mencionadas, localizadas en áreas distantes del epitelio pueden representar además macrófagos residentes y reclutados, con actividad fagocitaria, distribuidos por la lámina propia.

La presencia de células CD68+ en la capa basal del epitelio coloca en duda su naturaleza debido a que, según algunos autores (33, 34, 35, 36, 37) no sólo los macrófagos, sino que también las células de Langerhans residentes en las camadas basal y suprabasal del epitelio expresan moléculas citoplasmáticas como el antígeno CD68.

La localización intra vascular de las células CD68+ también permite cuestionar su fenotipo celular, ya que, según algunos autores (12, 38), tanto los macrófagos, así como las células de Langerhans son de origen sanguíneo a partir del tejido mielóide y ambas migran para los linfonodos regionales, a través de los vasos linfáticos, con el objetivo de realizar la presentación antigénica. Se ha demonstrado que la marcación CD68 de las células dendríticas se limita a una distribución peri nuclear y que en los macrófagos esa marcación es más citoplasmática y difusa. Sin embargo, en éste estudio no fue posible realizar tal distinción (33).

Con relación a la densidad de marcación celular para el anticuerpo anti-CD68, el valor 2 fue predominante en más de la mitad de las muestras de gingivitis crónica (10 casos), seguido por el valor 1 observado en 5 casos y el valor 3 encontrado en sólo 2 especimenes. Por otro lado, en la periodontitis crónica, la mayoría de las muestras (18 especimenes) exhibió el valor 1 de densidad de marcación celular para el anticuerpo anti-CD68 y sólo 7 casos presentaron el valor 2.

El análisis estadístico de esos resultados demostró una diferencia significativa en la densidad de marcación para el anticuerpo anti-CD68 entre los grupos estudiados, se reveló la densidad de las células CD68+ mayor en la gingivitis que en la periodontitis crónica. Esos datos concuerdan con los de la literatura consultada, en la cual fueron encontrados relatos que hacen referencia a la densidad decreciente de los macrófagos con relación a la etapa de la enfermedad periodontal. Siendo que en las etapas más avanzados de la enfermedad periodontal (priodontitis crónica), los macrófagos son sustituidos por los linfocitos y plasmocitos. Se ha reportado además que la reducción de la densidad macrofágica en la periodontitis crónica también puede ser atribuida a la migración de esas células para los linfonodos regionales con el objetivo de realizar la presentación antigénica (3, 8, 15, 16, 17, 18).


Conclusión
Los macrófagos presentan un patrón de distribución celular difuso, se localizan preferencialmente en posición yuxtaepitelial, a pesar de que también puedan ser observados en áreas distantes del epitelio, y exhiben una mayor densidad de marcación celular en la gingivitis que en la periodontitis crónica, lo que sugiere una mayor participación de esas células en la patogénesis de la gingivitis.