Trabajos Originales

Efecto de la Cotinina en la viabilidad de Fibroblastos

  • Aurora E. Traverso Martínez
  • Karina Gonzales Silvério
  • Carlos Rossa Jr.
Recibido para arbitraje:12/10/2002
Aceptado para publicación: 06/05/2003

RESUMEN
El objetivo del estudio fue evaluar "in vitro" el efecto de la cotinina en la viabilidad celular utilizando un linaje continuo de fibroblastos. Fueron formados grupos experimentales según las concentraciones de cotinina: 0 (control), 50ng, 100ng, 500ng, 1ug/ml. y tiempo de condicionamento (1, 24, 48 horas). Cada uno de los 12 orificios de una placa para cultivo celular recibió 1 mL de medio de Eagle y 1mL de cotinina en las diferentes concentraciones, inmediatamente fue acrescentado 1ml de medio de cultivo conteniendo 1x105 cels/mL. Después del condicionamento con la droga, en los 3 períodos ensayados, las células fueron teñidas con azul de tripan 0,4% y observadas en un microscopio invertido, por un examinador ciego para los grupos experimentales. Los experimentos fueron repetidos 5 vezes. Los resultados mostraron que las dos concentraciones mayores de cotinina presentaron los menores porcentajes de células viables, sin embargo, esta diferencia fue reducida. La viabilidad celular presentó una pequeña disminución con el aumento del tiempo de condicionamiento. Concluimos que la cotinina puede afectar la viabilidad celular solo en las dos mayores concentraciones ensayadas.

Palabras clave: cotinina/ efectos adversos, fibroblastos, tabaco.

ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate, in vitro, the effect of cotinine on the viability of fibroblasts from a continuous lineage. Experimental groups were formed according to drug dosage: 0 (control), 50ng, 100ng, 500ng, 1ug/ml, and time of exposure: (1, 24, 48 horas).Twelve wells microplates were used. Each well received 1ml of Eagle medium and 1ml of a solution containing 1x105 cells/ml. Cotinine at the tested concentrations was then added to the wells. After the incubation period, cells viability was assessed by using trypan blue 0,4%. Cell viabylity were assessed on a inverted micorscope, by the single examiner who was blend to the experimentals groups. The experiment was repeated 5 times. Results demostrated that the two greater concentrations presented the more non viable cells, but these diferences were minimal. The cells viability presented minimal decreased with the increased of time exposure. Cotinine affect fibroblasts for the high tested dose.

Key words: cotinine/ adverse effects, fibroblasts, tobacco


INTRODUCCIÓN
La relación entre el hábito de fumar y la prevalencia y severidad de la enfermedad periodontal han sido discutidos por mucho tiempo1. Investigaciones recientes han sugerido que este hábito es uno de los factores de riesgo mas significativos para el desarrollo y progresión de la enfermedad periodontal2. Las razones para esta asociación entre el consumo de tabaco y enfermedad periodontal son desconocidas, algunos autores3 la atribuyen a efectos locales como el nivel de higiene bucal, otros lo relacionan con una alteración en la composición de la microbiota subgingival permitiendo una mayor proporción de patógenos periodontales4. Por otro lado, otros autores resaltan la influencia de este hábito sobre el sistema inmune, como la disminución de la fagocitosis y quimiotaxia de leucócitos polimorfonucleares5 reducción de la producción de anticuerpos y disminución de la viabilidad de linfocitos T.6,7

La nicotina es considerada uno de los componentes mas importantes del tabaco debido a su potencial tóxico, sin embargo, su media vida biológica en el plasma es muy corta, siendo de aproximadamente 30 minutos. La mayor parte de la nicotina es rápidamente convertida en su principal metabolito, la cotinina, la cual posee una vida media biológica de 10 a 30 horas8. La cotinina permanece en el organismo de los fumadores por mucho tiempo, razón por la cual viene siendo usado como marcador bioquímico del uso de tabaco. Las ventajas de la utilización de la cotinina como marcador del hábito de fumar y de su intensidad radica en que se mantiene constante y se presenta en el plasma por largos períodos de tiempo, además de encontrarse en concentraciones elevadas que facilitan su medición9.

Mc Guire et al.10 (1989) demostraron que la cotinina está presente en la saliva y en el fluído crevicular de fumadores crónicos, siendo estas concentraciones de 5 a 6 veces mayores que en la saliva. Gonzáles et al.9 (1996) encontraron una relación positiva entre los niveles de cotinina y la perdida de inserción periodontal en fumadores.

El objetivo de presente estudio fue evaluar "in vitro" el efecto de la cotinina sobre la viabilidad celular según la dosis y el tiempo de exposición, empleando un linaje continuo de fibroblastos.

MATERIALES Y MÉTODOS
Fueron utilizadas células McCoy* (linaje continuo con morfología de fibroblastos) las cuales fueron mantenidas en frascos para cultura celular** (25cm2 de área de crecimiento celular) conteniendo medio de Eagle suplementado* (MEM) con 7.5% de suero fetal bovino*** y 40ug/ml de gentamicina****. El cultivo fue mantenido en incubadora con una humedad controlada de 98% y temperatura de 370C.

Test de Viabilidad Celular
La viabilidad fue determinada por el test de exclusión del colorante azul de trypan. Células viables son impermeables a este corante, una vez que su penetración en la célula indica la perdida de integridad de su menbrana11. Fueron ensayadas las siguientes concentraciones de cotinina*****: 0-controle, 50ng, 100ng, 500ng, 1ug/ml siendo que el tiempo de incubación fue de 1, 24 e 48 horas.

Cada pozo de una placa para cultivo** celular de 12 orificios recibió 1mL de médio de Eagle suplementado y 1mL de medio de Eagle conteniendo a cotinina en las diferentes concentraciones, inmediatamente fue acrecentado 1mL de suspensión de medio de cultivo conteniendo aproximadamente 1x105 cels/mL.

Los fibroblastos fueron incubados en ambiente controlado por períodos de 1, 24, e 48 horas, siendo teñidos con azul de trypan***** 0,4% por 5 minutos. Después de la remoción de la sustancia por aspiración y lavado dos veces con solución de tampón fosfato (PH 7,4) fue colocado 2ml de tampón para determinar la viabilidad celular. Fue seleccionado un campo aleatóriamente, efectuándose el contaje de hasta 200 células, determinando el número de células teñidas y no teñidas. Para la evaluación fue utilizado un microscopio invertido (aumento de 40X).

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Como los datos de viabilidad celular no se ajustaron a la distribución normal, fueron utilizados métodos no paramétricos de análisis. Los efectos de las diferentes concentraciones de cotinina utilizadas en cada uno de los períodos de condicionamiento sobre la viabilidad celular, fueron evaluados de forma independiente por el test de Kruskal-Wallis. Para la comparación de los efectos de cada dosis de cotinina entre los diferentes períodos de condicionamiento, fue utilizado el test de Mann-Whitney. La verificación de la existencia de algún tipo de asociación entre las concentraciones de cotinina utilizada y el porcentaje de células viables fue evaluado por medio de test de tendencia basados en la distribución del Qui-cuadrado. Los cálculos fueron utilizados por medio del software Bioestat 2.0.

RESULTADOS
El gráfico 1 representa los resultados para el análisis de viabilidad celular de la cotinina, puede observarse que hubo una reducción gradual del número de células viables con el aumento del tiempo de condicionamiento, sin embargo esta reducción ocurrió de forma bastante similar entre las diferentes concentraciones de cotinina ensayadas. A pesar de que la diferencia ser bastante reducida, se puede notar que las dos concentraciones mayores de cotinina presentaron los menores porcentajes de células viables.

Los resultados del test de Kruskal Wallis para la evaluación de la influencia del período de condicionamiento (3 grupos) sobre el porcentaje de células viables en cada concentración de cotinina utilizada (5 niveles) mostraron que apenas para los grupos control (sin cotinina) y 100ng/mL la diferencia entre los períodos alcanzó significancia estadística al nivel de 95%. Puede observarse un comportamiento razonablemente uniforme en todas las concentraciones ensayadas, ya que todas presentaron significancia al nivel de 90% y el comportamiento de reducción gradual de los puestos medios, indicando disminución de la viabilidad celular, con el aumento del tiempo de condicionamiento.

La influencia de la concentración de cotinina sobre la viabilidad celular en cada período de condicionamiento no fue significativa, excepto para el periodo de 24 horas, cuando hubo diferencia al nivel de 90% de significancia (p=0.07). En el periodo de 24 horas la diferencia entre las concentraciones mayores (500ng/mL e 1ug/mL) fue mas evidente, en cuanto los periodos de 1 y 48 horas, el porcentaje de células viables fue bastante similar entre las diversas dosis.

En relación a la tendencia de reducción de la viabilidad con el aumento del periodo de condicionamiento, este no resultó estadísticamente significante cuando fue evaluada por el test de tendencia.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Son escasos los estudios que han investigado el papel de la cotinina, en las principales funciones de los fibroblastos. Sabemos que la cotinina es un metabolito primario de la nicotina, siendo que esta sustancia tiene un elevado poder citotóxico, que según algunos autores puede llevar a la muerte celular12,13,14. Por tal razón, la cotinina al ser un metabolito de la nicotina tiene la particularidad de presentar similaridad estructural15 lo que nos llevaría a soponer que los mismos receptores celulares para nicotina podrían interactuar con la cotinina, pudiendo presentar los mismos efectos tóxicos atribuidos a la nicotina.

La diferencia en la proporción de células viables, tanto en las diferentes concentraciones de cotinina ensayadas, cuanto a los diferentes periodos de condicionamiento, fueron bastante reducidas. La cotinina en dosis reducidas parece haber ejercido un efecto protector de la viabilidad celular. En cuanto al tiempo de condicionamiento verificamos que hubo una reducción gradual del número de células viables con el aumento del tiempo de condicionamiento. A pesar de no ser significativa la diferencia entre los grupos evaluados, percibimos que los dos concentraciones superiores (500ng e 1ug/mL) presentaron menor porcentaje de células viables en los tres periodos de condicionamiento. Sin embargo nuestros resultados difieren de los relatados por James et al.15 (1999), para estos autores, la cotinina en dosis superiores a 10ug/ml tendría un efecto inhibitorio en la proliferación celular de fibroblastos oriundos del ligamento periodontal. Las posibles discrepancias entre los resultados pueden ser atribuidas a la diferencia entre las concentraciones ensayadas y los diferentes periodos de incubación. Sin embargo acreditamos que la diferencia fundamental estaría en los diferentes linajes de fibroblastos empleados y que sería esta heterogeneidad fenotípica la responsable del comportamiento diferente frente a la misma sustancia.

Un gran número de linajes celulares ha sido utilizado para evaluar los efectos biológicos de los productos del tabaco. Se discute en la literatura, si las células de linajes primarios o de linajes continuos deben ser empleadas en estos experimentos. Las células obtenidas de cultivos primarios tienen la ventaja fundamental de poder ser extraídas de tejidos como pulpa, tejido conjuntivo gingival, ligamento periodontal, etc. Estas células presentan un carácter cromosómico diploide, velocidad de proliferación lenta y un ciclo vital finito. A pesar que el cultivo primario presenta características biológicas ideales, las dificultades de cultivo son elevadas, siendo rápidamente contaminados en razón de su lenta proliferación. Por otro lado los linajes continuos, pertenecen a la categoría de células alteradas, transformadas o tumorales, pudiendo no reflejar la real condición biológica. Sin embargo ellas presentan posibilidades ilimitadas de tests, con resultados similares, así como son fáciles de cultivar debido a su rápida proliferación. Debido a estas características, rápida proliferación y mejor facilidad de cultivo fue empleadp un linaje contínuo de fibroblastos en el presente trabajo16.

No podemos olvidar que existen diferencias en la interpretación entre las mediciones hechas "in vivo" e las evaluadas "in vitro". Por ejemplo, la toxicidad celular "in vitro" es un evento puramente celular, siendo muy difícil recrear el complejo sistema farmacocinético de las drogas, así como la respuesta tisular del organismo. No obstante, cualquier evaluación hecha "in vitro" presenta la ventaja de poder controlar mas fácilmente las variables experimentales17.

Intentar entender los procesos celulares es una tarea difícil, en la actualidad los modelos experimentales "in vitro" como el cultivo de células nos son de gran ayuda para aumentar el conocimiento relativo al comportamiento de las principales unidades biológicas en los seres vivos. Siendo el fibroblasto la principal célula de los tejidos periodontales18 es de mucha importancia conocer su funcionamiento y las posibles alteraciones que puede sufrir por los diferentes agentes injuriantes. Podemos concluir que apenas las concentraciones de cotinina mas elevadas (500ng/mL e 1ug/nL) resultan en una discreta reducción de la viabilidad celular en un periodo de 24 horas. Parece ser que la cotinina puede afectar la viabilidad celular solo en elevadas concentraciones.

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