Trabajos Originales

• Germán Pardi. Profesor Asociado, Jefe del Departamento de Ciencias Básicas II, Facultad de Odontología, U.C.V.
• Marianella Perrone. Profesor Titular, Jefe del Laboratorio de Microbiología del Instituto de Investigaciones Odontológicas Dr. Raúl Vincentelli y Coordinadora Adjunta de Investigación, Facultad de Odontología, U.C.V.
• Rosandra Mazzali de Ilja. Bioanalista Jubilada, Cátedra de Microbiología, Facultad de Odontología, U.C.V.

Recibido para arbitraje: 06/12/01
Aceptado para publicación: 24/01/02



INTRODUCCIÓN:
Trichomonas tenax es un protozoario que presenta una forma elipsoidal u ovoide, posee cuatro flagelos anteriores y un flagelo posterior o recurrente^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16}, los cuales junto con la membrana ondulante le confieren movilidad al mismo^4,8,17, es anaerobio facultativo^16,18 y se reproduce principalmente de forma asexual por división binaria en sentido longitudinal^3,7,18,19. Su temperatura óptima de crecimiento oscila entre 31°C. y 37°C y el pH óptimo en el cual se desarrolla varía entre ^{7,0 y 7.53,5,6,7,8,20}. No presenta fase quística^7,13 y posee un núcleo eucariótico con membrana limitante, así como ribosomas, retículo endoplasmático, aparato reticular de Golgi, vacuolas, lisosomas e hidrogenosomas en su citoplasma^{5,6,9,10,11,12,13,14,15,16}, teniendo estos últimos organelos mencionados gran importancia en el metabolismo anaeróbico por parte de esta especie¹⁶.

Además del hombre, algunos animales como monos, perros y cachorros de gatos pueden ser hospederos naturales de T. tenax, alojándolo en sus cavidades bucales como microorganismo comensal⁸. Este microorganismo vive en el cálculo dental y forma parte integrante de la microbiota que conforma la placa dental subgingival^{7,14,21,22,23}.

La detección de T. tenax en la cavidad bucal humana es indicio de una higiene bucal deficiente, por lo que su incidencia aumenta de manera significativa en los pacientes que presentan problemas periodontales, siendo esta de tres a cuatro veces mayor que en los sujetos periodontalmente sanos^13,15,24,25.

Son numerosos los investigadores que han podido aislar a este microorganismo a partir de muestras de cálculo dental y placa dental subgingival en grupos de pacientes con problemas periodontales, tal y como se especifica a continuación (TABLA 1):

La incidencia de T. tenax en pacientes con Gingivitis Ulcerativa Aguda ha sido puesta de manifiesto en varios reportes publicados al respecto. Destacan esos reportes que dicha incidencia oscila entre un 12% y un 32%, en relación con el número total de pacientes estudiados con la enfermedad antes señalada^32,33.

Se ha podido demostrar la existencia de dificultades para poder diagnosticar la presencia de T. tenax en aquellos pacientes que presentan micosis en la cavidad bucal, según lo refiere un estudio realizado a 1.018 pacientes con la condición antes señalada, de los cuales se pudo aislar el protozoario a 148 (14,5%) de los mismos. Tambíén se señala en el mismo estudio que las dificultades para la identificación de T. tenax estaban estrechamente relacionadas con la infección por hongos³⁴.

En otro estudio realizado por Kurnatowska y Kurnatowski35, se tomaron muestras de saliva a 936 pacientes, encontrándose T. tenax en 90 de éstos, de los cuales en 85 casos fueron identificados a su vez hongos, estableciéndose por lo tanto que la trichomoniasis en cavidad bucal estaba complicada con micosis. Este diagnóstico fue más frecuente en pacientes con Leucoplasia y con Liquen Wilsoni. También se pudo establecer en esta investigación, una asociación estadísticamente significativa de T. tenax con hongos y pacientes con xerostomía, sensación de quemadura, sacos periodontales y raices expuestas. El protozoario no se encontró en ningún paciente con Caries Dental ni con Estomatitis Aftosa Recurrente.

Tomando en consideración todo lo anteriormente expuesto, el propósito de este estudio fue determinar la incidencia de T. tenax en un grupo de pacientes con P.M.C., quienes asistían a la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela, a fin de recibir tratamiento odontológico.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Selección de los pacientes:
En este estudio, se seleccionaron 60 pacientes que asistían a la Facultad de Odontología de la U.C.V. por diversos motivos. Estos pacientes fueron divididos en dos grupos:

1) Grupo Experimental: Conformado por 30 pacientes adultos que tenían P.M.C. (diagnóstico previamente establecido en sus historias clínicas), quienes aún no habían recibido tratamiento periodontal, de los cuales 17 eran del sexo masculino y 13 del sexo femenino y cuyas edades oscilaban entre 20 y 55 años. A cada uno de estos pacientes se les realizó observación clínica de sus cavidades bucales, denotándose gran cantidad de cálculo dental y de detritus, lo que indicaba desde luego una higiene bucal deficiente. Para confirmar que tenían P.M.C., se les tomaron a cada uno de los pacientes radiografías de la zona elegida, previo a la toma de las muestras, para así evidenciar la pérdida ósea característica de esta enfermedad.

2) Grupo Control: El cual estaba conformado por 30 pacientes adultos, a quienes ya se les habían realizado los procedimientos de tartrectomía y de técnicas de enseñanza de higiene bucal, siendo satisfactorias las condiciones periodontales, así como la higiene bucal de los mismos. Dichos pacientes no tenían historia de P.M.C. y se encontraban en la fase resolutiva del tratamiento odontológico (instalación de prótesis parcial fija, instalación de prótesis parcial removible en los casos requeridos o culminación de la Odontología Operatoria en los que no requerían tratamiento protésico). La edad de estos pacientes oscilaba entre 22 y 63 años y en cuanto al sexo, 15 eran masculinos y 15 eran femeninos.

Toma y Recolección de las muestras:
Para realizar la toma de la muestra de los pacientes de ambos grupos, se seleccionó la zona anteroinferior de cada uno de estos tanto por vestibular como por lingual, debido a que en esa zona existía gran cantidad de cálculo dental acumulado, así como de detritus y de placa dental subgingival (en los pacientes con P.M.C.). Del grupo de pacientes periodontalmente sanos se tomaron muestras de placa dental subgingival, ya que no tenían ni detritus ni cálculo dental en sus dientes.

Para la remoción del cálculo dental, así como de los detritus y de la placa subgingival se utilizaron tartrectomos y curetas periodontales previamente esterilizadas, tomando el material con estas últimas del fondo de los sacos periodontales de los pacientes con P.M.C. Asimismo, se tomaron muestras de placa dental alrededor del cuello de los dientes de los pacientes del grupo control, empleando para ello curetas previamente esterilizadas. El cálculo dental removido de los pacientes del grupo experimental, fue triturado previo a la siembra y a la observación microscópica, utilizando para ello varillas de vidrio previamente esterilizadas.

Transporte de las muestras:
Las muestras tomadas fueron colocadas en los viales conteniendo el medio de transporte (Solución de Ringer estéril) y llevadas al laboratorio para su posterior siembra y observación microscópica.

Siembra de las muestras:
Una vez que fueron llevadas las muestras al laboratorio, se tomaron 0,1 ml. de la solución de Ringer que contenía este inóculo, utilizando para ello pipetas estériles de 1 ml, inoculándose la cantidad antes señalada en el caldo selectivo de Kupferberg, empleado para el crecimiento de T. tenax (Kupferberg Trichomonas Broth. Difco Laboratories, Detroit, Michigan, U.S.A.), al cual se le añadieron 0,1 g de Cloranfenicol para evitar el crecimiento de bacterias y otros microorganismos. Se realizaron dos siembras por cada paciente, una en aerobiosis y la otra en anaerobiosis, utilizando la jarra destinada para tal fin (Gas Pak). Los medios de cultivo sembrados fueron llevados a la estufa a 37°C por 72 horas.

Observación Microscópica:
Para la identificación de T. tenax se realizaron observaciones microscópicas en tres ocasiones por cada paciente con la finalidad de determinar en cuales oportunidades existía la posibilidad de visualizar al flagelado. Estas observaciones se realizaron en primera instancia el mismo día de la toma de la muestra, tomando una gota del inóculo contenido en el medio de transporte con el asa de platino previamente esterilizada y colocado en una lámina portaobjeto. Las dos observaciones microscópicas restantes se realizaron a las 72 horas de haber incubado los medios selectivos en la estufa, tomando una gota con el asa de platino previamente esterilizada, tanto del caldo que se sembró en condiciones de aerobiosis como del que se sembró en anaerobiosis, colocándola en cada caso sobre la superficie de su respectiva lámina portaobjeto.

En cada una de las ocasiones antes descritas, se colocó sobre la gota de suspensión microbiana una laminilla cubreobjeto, para realizar posteriormente la observación al fresco, mediante el uso del microscopio de luz (marca Leitz), enfocando primero con un lente de poco aumento (10 x) y después con lentes de mayor aumento (20 x y 40 x).

RESULTADOS:

Hallazgos Microbiológicos:
El crecimiento microbiano en el caldo selectivo (K.T.B.) fue claramente evidenciado por la aparición de una turbidez característica en el medio, así como la aparición de un sedimento en el fondo del mismo. Asimismo, se pudo observar un cambio de color del medio de azul a amarillo, debido al mismo crecimiento celular (FIGURA 1).

La observación al fresco de las láminas preparadas permitió visualizar en los casos que se consideraron como positivos, a los flagelados desplazándose en algunos casos con movimientos circulares y en otras ocasiones sin moverse y aislados. Usualmente, los morfotipos flagelados de T. tenax pueden ser observados con cuatro flagelos, pero en algunas ocasiones, pueden ser vistos solamente con uno o dos flagelos (FIGURA 2).

Incidencia de T. tenax:
Los resultados de este estudio revelaron que T. tenax fue encontrado en 9 pacientes (30%) del grupo experimental (casos positivos), mientras que el protozoario no pudo ser aislado en los 21 pacientes restantes (70%) de este grupo (casos negativos) (FIGURA 3). En relación con el grupo control, T. tenax se detectó solamente en 1 paciente (3%), siendo este el único caso positivo, en tanto que en 29 pacientes de este grupo (97%), este microorganismo no pudo ser identificado, considerándose todos estos casos como negativos (FIGURA 4).

Cabe destacar además que de los 9 pacientes del grupo experimental a quienes se les pudo aislar T. tenax de sus cavidades bucales, en 7 de ellos se pudo observar el flagelado al realizar la observación microscópica inmediatamente después de la toma de la muestra. En los casos de las observaciones microscópicas realizadas a partir de las muestras provenientes de los medios de cultivo 72 horas después de su incubación, creció el protozoario en los 9 medios de cultivo correspondientes a los casos positivos al sembrarlo en aerobiosis, en tanto que en las siembras en condiciones de anaerobiosis, creció el protozoario en 5 de los 9 casos positivos.

En cuanto al único caso positivo del grupo control, se pudo identificar a T. tenax tanto en el momento que se realizaron las observaciones microscópicas inmediatamente después de la toma y recolección de las muestras, como cuando se realizaron las observaciones al microscopio de luz de las muestras provenientes de las siembras por aerobiosis. No creció el flagelado al incubar los medios en condiciones de anaerobiosis, ni en éste, ni en ningún otro caso del grupo control.

La incidencia de este protozoario por sexo y por edad, tanto en los grupos experimental como control, serán expresadas a continuación (TABLAS 2, 3, 4 y 5):

Con respecto al sexo de los pacientes, es importante destacar que la proporción de pacientes masculinos del grupo experimental en los cuales se detectó T. tenax fue mayor que en los pacientes femeninos, ya que este protozoario fue identificado en 7 (23%) de los 17 pacientes masculinos y en 2 (7%) de los 13 pacientes femeninos (TABLA 2), mientras que el único caso positivo del grupo control (3%), era una paciente del sexo femenino (TABLA 3).

En relación con la edad de los pacientes del grupo experimental, la incidencia de T. tenax fue mayor en los grupos etarios comprendidos entre 31 y 40 años y entre 41 y 50 años que en el grupo de pacientes mayores de 50 años, ya que en cada uno de los dos primeros grupos antes señalados, el protozoario fue hallado en 4 (13,5%) de los 9 pacientes, mientras que en el último grupo señalado, se encontró el otro caso positivo (3%) (TABLA 4). La edad de la paciente del grupo control en la que se encontró T. tenax era de 42 años (TABLA 5).

DISCUSIÓN:
Mientras que la gran mayoría de los estudios sobre Microbiología bucal se refieren a diversos aspectos de la bacteriología, la protozoología bucal se ha dejado prácticamente al olvido, a pesar de la alta prevalencia de infecciones en adultos donde se encuentra T. tenax como agente etiológico²⁴.

Al respecto existen múltiples publicaciones donde se reporta la complejidad de la microbiota residente en la placa dental, no sólo en términos cuantitativos sino cualitativos incluyendo además de bacterias, hongos, micoplasmas y protozoarios, entre éstos T. tenax como parte integrante de ese sistema ecológico tan variado como lo es la cavidad bucal^15,36.

Por ello en el presente estudio se decidió determinar la incidencia de este protozoario en un grupo de pacientes con P.M.C., considerando que no existen reportes previos en nuestro pais sobre este importante aspecto de la patología periodontal.

Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron una mayor incidencia de T. tenax en el grupo de pacientes que tenían P.M.C., en relación con la baja incidencia de este protozoario en aquellos pacientes pertenecientes al grupo control. Resultados similares al nuestro han sido reportados en diversas publicaciones^{2,13,14,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31}.

No obstante, en un estudio realizado en 200 pacientes con P.M.C. no se aisló T. tenax en ninguno de los mismos³⁷.

Otra investigación reveló diferencias muy claras desde el punto de vista microbiológico entre la microbiota predominante en la placa dental subgingival de individuos periodontalmente sanos y en aquellos que presentaban Enfermedad Periodontal avanzada. Las observaciones fueron realizadas mediante el empleo del microscopio de contraste de fases²².

En los sujetos estudiados que presentaban Enfermedad Periodontal avanzada se observó un alto porcentaje de espiroquetas y de bacilos agrupados en organizaciones de cepillos de limpiar tubos, así como T. tenax, en tanto que en los sujetos que no presentaban alteraciones periodontales se evidenció un predominio de bacilos filamentosos y cocos agrupados en asociaciones de mazorca de maíz. No se evidenció en cambio la presencia de T. tenax en ninguno de los sujetos de este grupo²².

Lo anteriormente señalado ratifica la vigencia de la Hipótesis Específica de la Placa Dental, enunciada por Loesche³⁸, en la cual postula la especificidad de los microorganismos predominantes en la placa dental subgingival en relación directa con la presencia o la ausencia de Enfermedad Periodontal.

El sexo no parece tener influencia en la proporción en la cual se detectó T. tenax en los pacientes del grupo experimental, aún cuando la incidencia de este protozoario fue ligeramente mayor en los pacientes del sexo masculino. Resultados similares se han obtenido en cuanto al sexo, de acuerdo a lo expuesto en varias publicaciones^14,21,23.

La edad es un parámetro importante a la hora de determinar la incidencia de T. tenax en pacientes con P.M.C. Los resultados de este trabajo coinciden con lo afirmado en varios reportes en el sentido de que cuando ésta aumenta, la incidencia del flagelado en los grupos de pacientes con la característica antes señalada es mayor ^{14,15,19,21,28}.

Aún cuando se ha afirmado que T. tenax está ausente en las cavidades bucales de niños y adolescentes ^{14,15,19,21,28}, esto no es del todo cierto ya que se ha publicado un informe sobre la incidencia de este protozoario en niños y adolescentes con edades comprendidas entre 8 y 19 años, pudiéndose aislar tanto en pacientes con alteraciones periodontales, como en pacientes con la dentadura intacta y completamente restaurada39. Sin embargo, se ha podido demostrar que T. tenax no se encuentra presente en la cavidad bucal de niños muy pequeños⁴⁰.

La capacidad por parte de T. tenax de producir infecciones en la cavidad bucal puede incrementarse en aquellos pacientes que además de presentar cálculo dental, sean respiradores bucales o presenten hipertrofia de las papilas de la lengua (lengua pilosa)²¹.

Bózner y Demes^41,42 publican dos reportes en los cuales especifican que la actividad proteolítica de T. tenax viene mediada por proteasas de la cisteína o cisteinasas, las cuales no solamente son responsables de la hidrólisis del colágeno Tipo I, sino que pueden degradar otros tipos de colágeno, específicamente los tipos III, IV y V, todos presentes en los tejidos periodontales. Asimismo se sugiere la posible presencia de metaloproteinasas en T. tenax, las cuales pudieran contribuir a la actividad antes mencionada.

Puntualizan además que esta actividad enzimática lítica depende básicamente de la temperatura en la cual ocurra, siendo mayor a 35°C que a temperatura ambiente, así como el rango de pH en el cual ocurra, incrementándose notablemente cuando este oscila engtre 5 y 8 y en presencia de Ditiotreitol como activador enzimático, así como en presencia de iones sulfihidrilos.

También señalan que la inhibición de la proteólisis puede ocurrir debido a la presencia de varios inhibidores de la cisteinasa, tales como Iodocetamida, N-Metilmaleimida y N-a-Tosil-L-Lisina-Clorometil-Cetona (T.L.C.C.).

De los tipos de colágeno antes referidos, el Tipo IV es digerido más efectivamente, en tanto que el Tipo I es el más resistente a la acción de las enzimas sintetizadas por el protozoario^41,42.

Queda aún por aclarar si además de los efectos respectivos que ejercen las cisteinasas producidas por T. tenax sobre los tejidos periodontales, concretamente sobre la matriz proteica, cumplen otras funciones. De allí que se sugiera su posible implicación en la destrucción de varios componentes de diversa índole del sistema inmunológico del hospedero^41,42.

Por otra parte, se ha podido demostrar in vitro que la actividad proteolítica de células de T. tenax detectadas en muestras de placa dental humana, puede deberse a la presencia de endopeptidasas⁴³. También se ha demostrado que una cepa de esta especie (ATCC 30207) sintetiza dos tipos distintos de hemolisinas, una de naturaleza lipídica y la otra de naturaleza proteica, las cuales destruyen los glóbulos rojos humanos y de algunos animales (ovejas, conejos y caballos)⁴⁴.

Se ha comprobado, al menos de manera experimental que T. tenax no se adhiere a las células epiteliales ni a los fibroblastos porque no posee adhesinas o proteinas de superficie que permitan la unión como tal, en tanto que Trichomonas vaginalis si las posee, razón por la cual se puede adherir a las células antes nombradas, produciendo daño celular⁴⁵.

Recientemente, se han obtenido secuencias de los genes de la enzima fumarasa clase II en algunas especies de Trichomonas, a través de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (R.C.P.). Estos genes fueron expresados en Tritrichomonas foetus y en Tetratrichomonas gallinarum pero no en T. tenax ni en Trichomonas hominis⁴⁶.

Mediante el empleo de grandes concentraciones de fluoruro de sodio, las cuales oscilan entre 1.700 y 10.000 p.p.m., se ha podido comprobar que los protozoarios de la cavidad bucal humana no pueden sobrevivir. En cambio que con concentraciones de fluoruro de sodio que oscilen entre 2 y 1.000 p.p.m. pueden vivir normalmente, reproducirse e inclusive mostrar actividades comparables con las encontradas en los medios de cultivo donde se desarrollan de ordinario⁴⁷. Sin embargo, se ha demostrado como dato curioso que la incidencia de T. tenax en pacientes que consumían agua fluorurada era mayor que en aquellos pacientes que no consumían agua fluorurada, lo cual corrobora el hecho de que la fluoruración de las aguas en concentraciones pequeñas (1 p.p.m.) no tiene efectos tóxicos sobre este microorganismo²¹.

La observación microscópica al fresco de las muestras provenientes de cálculo dental y de placa dental subgingival mediante el empleo del microscopio de luz resulta imprescindible si se quiere lograr el hallazgo rápido de T. tenax, pudiéndose visualizar por lo general con uno o dos flagelos. No obstante, siempre se deben inocular las muestras en los medios de cultivo más adecuados y que permitan un hallazgo más seguro de esta especie^8,48.

CONCLUSIONES:

1. La incidencia de T. tenax fue mayor en los pacientes con P.M.C. que en los pacientes peridontalmente sanos.



2. La proporción en la cual se encontró T. tenax en los pacientes con P.M.C. fue mayor en los del sexo masculino que en los del sexo femenino.



3. La incidencia de T. tenax en los pacientes con P.M.C. fue mayor a medida que aumentaba la edad de los mismos.

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