Trabajos Originales

Recibido: 25/01/1999
Aceptado para publicación: 17/02/1999

• Rojas-Sánchez Fátima, Cátedra de Clínica Integral, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela.
• Lalaguna Fernando, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Unidad de Tecnología Nuclear.
• Infante Yanira, Laboratorio de Bioquímica, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela
• Acevedo Ana Maria, Instituto de Investigaciones Odontológicas "Raúl Vincentelli", Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela.
  
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  Fátima Rojas S, Cátedra de Clínica Integral 4to piso, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela, Telf. trabajo: 605-3806 Fax:2719173 Correo electrónico: [email protected]

Introducción
Fordick y col. (1953), disertaron sobre el uso de inhibidores químicos para reducir la producción de ácidos en la placa dental y la manera de controlar el desarrollo de caries dental. Estos autores demostraron que los inhibidores químicos para ser efectivos deben retenerse en la cavidad bucal para producir cambios significativos en la flora de la placa transformándola en una microbiota menos cariogénica. Estudios realizados empleando ácidos grasos (AG) de cadena media y larga como agentes anticariogénicos (Griffiths, 1979; Hayes, 1981; Hayes, 1984; Hayes y Roden, 1990; Hayes y Stobart, 1990; Hayes, 1994), reportaron que su efecto principal era la reducción del avance de lesiones cariosas e igualmente inhibir la producción de ácidos por los microorganismos asociados con la aparición de caries. Los AG actúan como sustancias aniónicas surfactantes (Hayes, 1979), que se absorben a la superficie de la bacteria produciendo cambios en la permeabilidad de la membrana, pérdida de su función y muerte celular; sin embargo, un requisito para que puedan darse estos efectos es que los AG se mantengan en soluciones acuosas.

Hayes (1981), demostró que las propiedades anticariogénicas del nonanoato de potasio (NK) y en general de los AG, eran inversamente proporcionales al tamaño de la cadena y que el mayor efecto inhibitorio sobre la producción de ácidos por la bacteria era cuando el AG poseía una cadena entre 8 y 14 carbonos, particularmente cuando la cadena era de 9, 10 y 11 átomos; e igualmente reportó que en un rango de pH 4,5-5,0 las especies ionizadas del compuesto eran la forma activa. Estudios in vivo en ratas han reportado resultados similares (Hayes, 1984). Hayes (1979), reportó en un estudio realizado en animales que entre los ácidos grasos analizados el nonanoato de potasio (NK) fue el mas efectivo en presencia de azúcares, inhibiendo específicamente las bacterias que mantienen los pH bajos por tiempo prolongado.

Hayes y Berkovitz (1979), estudiaron la efectividad del NK para reducir caries de fisura en ratas cuando la sal se incluyó en una dieta altamente cariogénica, demostrando una reducción significativa en el porcentaje de lesiones avanzadas en relación con el control, al utilizar concentraciones del NK entre el 1% y 5%. Los autores concluyeron que el NK podría utilizarse como un agente anticariogénico efectivo.

Koulourides en 1968, demostró que los fluoruros ejercen un efecto significativo sobre la tasa de remineralización en esmalte previamente desmineralizado. Aún a concentraciones de 0,5 mM los fluoruros aceleran la remineralización de 4 a 5 veces (Melberg y col., 1985), controlando de esta manera la pérdida de mineral (Gron y Hay, 1976), así como también reducen la utilización de glucosa por las bacterias de la placa (Hamilton, 1966; Sandham y Kleinberg, 1969, Featherstone et al., 1990, 1999).

Hayes y Stobart (1990) utilizando ácidos grasos (AG) entre 9-12 carbonos, específicamente el decanoato (DC) a una concentración de 0,5% y fluoruro de sodio (NaF) concentración 76 mgF/L, demostraron que el principal efecto de la mezcla (DC+NaF) fue reducir la tasa de progresión o retardar el avance de las lesiones cariosas, lo que indicó un buen grado de efectividad a las concentraciones evaluadas. Así mismo estos autores demostraron que la mezcla DC+NaF produjo un efecto aditivo ya que el efecto inhibitorio producido por la mezcla no fue mayor que la suma de los dos compuestos por separado. Los investigadores sugirieron que los fluoruros y el decanoato actuaban de manera independiente, el fluoruro promoviendo la acción remineralizante de lesiones tempranas de caries y los AG inhibiendo la flora acidogénica. Sin embargo, Rojas-Sanchez y col. (1990), en un estudio similar reportaron que el grado de inhibición de caries fue menor (32%) en el grupo de animales tratados con la mezcla (NK=0,5%; NaF=125 ppm) al compararlo con los compuestos utilizados individualmente y con el control, sin embargo, a diferencia del estudio de Hayes y Stobart (1990), los agentes fueron aplicados en el agua para beber. La contradicción observada en los dos últimos estudios mencionados nos condujo a estudiar de una manera mas controlada los compuestos utilizando un modelo "in vitro" que simula las condiciones existentes en la cavidad bucal.


Materiales y Métodos
Sujetos: Del universo de niños que asistieron al Servicio de Odontología Infantil de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela se examinaron 112 niños de ambos sexos, con edades comprendidas entre 5 y 12 años con las siguientes características: (1) que tuvieran historia de caries; (2) no sometidos a tratamientos médicos, (3) altos formadores de placa dental.

Para la recolección de muestras de placa se rasparon todas las superficies dentarias accesibles con una Hollenback No. 3, utilizando espejo plano No. 23 para la observación, evitando en lo posible aquellas superficies que presentaran lesiones cavitadas e igualmente tomando precauciones para no lesionar los tejidos blandos, y tanto el examen como la recolección de muestras fue llevado a cabo por un solo examinador. Las muestras de placa dental fueron recolectadas a las 9:30 AM, aproximadamente 3 horas después de la última ingesta de alimentos. Las muestras se colocaron en frascos de vidrio con cierre hermético y fueron conservadas en hielo hasta el procesamiento de las mismas. Para obtener una cantidad de placa necesaria se requirió hacer un pool (placa mancomunada) con placa de varios niños, con lo cual se disminuyó, en parte, la variación entre los individuos. Los pesos de las alícuotas del pool de placa fueron determinados sobre un portaobjeto por diferencia de pesada (balanza analítica digital Oertling, modelo LA164) inmediatamente después fueron suspendidas en una solución amortiguadora de fosfato 1 mM de pH apropiado (5,5 ó 7,4) a una concentración de 5 mg de placa húmeda/ml, y se homogeneizaron por 15 segundos en un homogeneizador de vidrio operado manualmente. La determinación de la tasa inicial de producción de ácidos a partir de carbohidratos exógenos en presencia y ausencia de inhibidores estuvo basada en el método descrito por Hayes y Roberts, (1980) que requiere colocar 1,5 ml de la suspensión a analizar en un recipiente de vidrio mantenido a 37 ºC con agitación continua en la cual se sumerge el electrodo Orion, modelo 91-00-92 (Orion Research Co., Mass).

Para la lectura se usó un potenciómetro Orion, modelo 701A (Orion Research Co., Mass.) y un registrador Cole-Parmer, (Cole Palmer Instrument Co). La suspensión de placa se dejó aproximadamente 20 min, con el fin de que se metabolizaran los carbohidratos exógenos. Al alcanzar el pH de trabajo deseado se agregó a la suspensión 1,5 µl de una solución de glucosa 100 mM. La velocidad de producción de ácidos se determinó graficando el logaritmo neperiano de la concentración de hidrogeniones (H+) contra el tiempo. Los resultados se expresaron en µmol H+ producidos por mg de placa húmeda por hora.

A pH 7,4 se hizo lo siguiente: (i) para determinar la concentración de NK necesaria para producir una inhibición de 50% en la producción de ácidos se realizó una curva de concentración utilizando las concentraciones 1; 3; y 8 mM seleccionándose 3 mM nonanoato de potasio; (ii) mientras que para fluoruro de sodio se utilizó 13 mM (Acevedo, 1982); (iii) la mezcla de los compuestos utilizando las concentraciones anteriormente mencionadas. Luego de realizarse este procedimiento por duplicado se procedió a estudiar el efecto de los diferentes compuestos. Los resultados obtenidos luego de agregar los compuestos se denominaron experimentales. Debido a que al utilizar los compuestos individualmente a pH 5,5 a las concentraciones mencionadas anteriormente la inhibición producida por el NK y el NaF a pH ácidos fue de 100%, se procedió a determinar las concentraciones adecuadas para evaluar el comportamiento de los compuestos a pH 5,5. Para ello se realizó una curva de concentración agregando a las suspensiones de placa: 0,06; 0,13; 0,20; 0,26; 0,5 y 1 mM (NK) y 0,13; 0,5; 0,26; y 0,50 mM (NaF). Las determinaciones se hicieron por duplicado. Cada una de las determinaciones se realizaron sobre 5 pooles de placa dental distintos.


Análisis Estadísticos
La homogeneidad de los datos en los diferentes grupos se verificó usando los tests de Cochran, Bartlett y Hartley. Los datos fueron analizados usando el test para análisis de varianza de una vía (ANOVA) y el test de Mann-Whitney para comparaciones múltiples. (Sidney, 1975; Downie, 1995).


Resultados
Las concentraciones de NaF y NK, aplicadas por separado, que resultaron en un 50% nominal de inhibición de la producción de ácido a pH 7,4 fueron 13 mM para el NaF y 3 mM para el NK. Para los experimentos a pH 5,5 la concentración que resultó en un 50% de inhibición fue la misma para ambos compuestos (0,26 mM). En la tabla 1 se puede observar que a pH 7,4 las placas mancomunadas asignadas aleatoriamente a los tratamientos, mostraron un orden de producción de ácidos distinto antes y después de aplicar los agentes. Sin embargo, a pesar de las diferencias observables cualitativamente (por simple verificación) los valores dentro de cada categoría no fueron diferentes significativamente. Los pooles de placa no tratadas que mostraron una mayor producción de ácidos fueron los asignados al tratamiento con la mezcla NK+NaF (2.213,6±206,2 µmol H+) seguidos de los asignados a ser tratados con NaF (2.009,4±146,5 µmol H+) y finalmente las correspondientes a las tratadas con NK (1.762,5±169,9 µmol H+). Los valores correspondientes a los grupos donde se añadieron los compuestos individualmente (NaF, NK) presentaron valores más bajos (904,4±76,6 y 998,2±177,4 µmol H+) respectivamente, que en los experimentos donde se utilizó la mezcla NK+NaF (1.324,1±92,5 µmol H+). Al realizar las comparaciones entre los valores obtenidos, utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney estas indicaron que las diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas (p<0,028) entre todas las muestras evaluadas a pH 7,4.

A pH 5,5 (tabla 2) también se observaron diferencias en la secuencia de producción de ácidos, aunque el rango fue menos amplio que a pH 7,4. Los pooles de placa no tratadas que presentaron una mayor producción de ácidos fue el NK+NaF (794,2±80,6 µmol H+), seguido por el grupo NaF (628,7±101,8 µmol H+). El grupo de pooles no tratados que presentaron una menor producción de ácidos fue el NK (581,0±98,5 µmol H+). En este caso tampoco hubo diferencias significativas entre los datos correspondientes a las muestras no tratadas. En las muestras tratadas con NK se observó la mayor producción de ácidos (458,5±73,6 µmol H+), seguida del grupo de muestras tratadas con el NaF (450,0±110,7 µmol H+). Las muestras tratadas con la mezcla (NK+NaF) produjeron la menor cantidad de ácidos (391,0±52,3 µmol H+). Al compararse los datos aplicando el test de análisis de comparaciones de Mann-Whitney solo se observó la presencia de diferencias estadísticamente significativas entre las muestras tratadas con los agentes individualmente y las tratadas con la mezcla (p<0,001), mientras que las otras combinaciones analizadas no fueron estadísticamente diferentes.

En la tabla 3 se ilustran los valores correspondientes a los porcentajes de inhibición en la producción de ácidos en presencia de los diferentes compuestos individualmente y su mezcla a pH 7,4 y 5,5 y utilizando la concentraciones 13 mM y 3 mM NK para el primer pH y 0,26 mM para el segundo. El mayor porcentaje de inhibición a pH 7,4 se observó al utilizar el compuesto NaF (54,5%), seguido por NK y la mezcla (NK+NaF), donde los resultados fueron muy similares numéricamente, 45,0% y 39,3%, respectivamente. Al compararse los datos aplicando el test de análisis de comparaciones de Mann-Whitney no se observó la presencia de diferencias estadísticamente significativas.

Al analizar los resultados en cuanto a los porcentajes de inhibición a pH 5,5 se observó que las muestras tratadas con la mezcla presentaron el mayor porcentaje de inhibición (49,3%). Los valores de inhibición correspondientes a los agentes aplicados individualmente fueron NaF=29,3% y NK=21,2%. Cuando los valores promedios de inhibición se analizaron estadísticamente observamos que solo se encontró diferencias al comparar las muestras tratadas con los agentes individualmente y las tratadas con la mezcla (p<0,001), mientras que las otras combinaciones analizadas no fueron estadísticamente diferentes.

Discusión
Actividad Bacteriana en las muestras de placa dental
La capacidad productora de ácidos de las bacterias de la placa dental puede ser determinada sensitivamente por medición de la acidez titulable resultante del catabolismo anaeróbico de carbohidratos exógenos. Nuestro método permite medir la producción de ácidos a pHs predeterminados del medio

(5,5 y 7,4), lo cual constituye una ventaja para evaluar inhibidores pH-dependientes tales como los ácidos grasos (AG). La actividad acidogénica de la placa se expresó sobre la base del peso húmedo de la misma, ya que se ha demostrado que en esta base la actividad no varía grandemente día a día en muestras colectadas de un individuo (Griffiths, 1979).
Considerando estos factores, se tomó como medida de la inhibición de la actividad acidogénica de la placa dental, cualquier reducción en la producción de ácidos después del tratamiento de las muestras de placa con los inhibidores.

En diferentes estudios se ha encontrado una alta variabilidad en la composición química y microbiológica de la placa dental, tanto entre individuos como en un mismo sujeto (Ashley, 1975; Tatevossian, 1975; Ashley et al., 1991; Wilson y Ashley, 1990). Con el fin de controlar en nuestros estudios la variabilidad entre individuos se trabajó sobre muestras mancomunadas de placa dental preparadas a partir de porciones de placa dental tomadas de las superficies accesibles lisas y proximales de 112 niños, estas muestras representan el promedio de un grupo de individuos mas que de un sitio con caries activa.

Efecto del Fluoruro
Esta ampliamente demostrado que el fluoruro inhibe el metabolismo de los azúcares por las bacterias de la placa dental (Hamilton, 1977; Eisenberg y Maquis, 1981). Nuestros resultados (Tabla 1) corroboran lo anteriormente dicho y en particular concuerdan con los resultados reportados por Acevedo (1982), quién encontró un 50% de inhibición a pH 7,4 con una concentración de 13 mM de NaF en el medio. Sobre la base de estos resultados se decidió usar un valor de 50% de inhibición en la producción de ácidos a pH 7,4 como nivel de referencia para comparar los efectos de los inhibidores ensayados.

La inhibición reportada es real, por cuanto que la actividad acidogénica de la placa dental en ausencia y presencia de los agentes son diferentes estadísticamente (p>0,05;n=5).
Dado que el pH de la placa dental cariogénica es bajo (Kleinberg, 1970), y que se ha postulado que el aumento de la cantidad de HF formada a expensas del NaF del medio a pHs ácidos puede determinar que la inhibición por fluoruro ocurra por un mecanismo independiente (Hayes y Roden, 1990) a la inhibición del metabolismo de los azúcares (Hamilton, 1977; Eisenberg y Maquis, 1981), se incluyó determinar la inhibición de la acidogénesis por fluoruro a pH 5,5.

El ajuste del pH del medio a 5,5 causó per se que la actividad acidogénica fuera menor. Hayes y Roden (1990) trabajando sobre Streptococcus downei encontraron el mismo tipo de efecto.

Conociendo previamente la inhibición de la producción de ácidos por efecto de pH y para que pudiéramos calcular la inhibición real producida por el compuesto, se encontró que una concentración 0,26 mM de NaF en el medio llevaba significativamente la inhibición al rango de 50% (Tabla 2). La concentración de NaF necesaria para alcanzar la inhibición nominal de 50% a pH 5,5 es marcadamente inferior a la requerida a pH 7,4 que, aunque a pH 5,5 la inhibición de referencia de 50% no es debida sino parcialmente al NaF, permite sugerir que las bacterias en la placa mancomunada a pH 5,5 se encuentran ya sometidas a condiciones de estrés tales que: afectan su capacidad de tolerar otra condición de estrés, que el mecanismo por el que actúa el NaF a pH 5,5 el cual es más efectivo (Hayes y Roden, 1990) que el operativo a pH 7,4 (Hamilton, 1969) o que se tiene una combinación de ambos.

Efecto del nonanoato de potasio
Entre las alternativas sugeridas para inhibir las bacterias acidogénicas en placa dental están las de Sutton y Marquis (1987), quienes sugieren el uso de sustancias que, como los ácidos grasos, disipan el gradiente transmembrana de pH, acidificando el medio interno de la bacteria e inhibiendo las enzimas glicolíticas pH-dependientes (Padan y cols., 1981; Iwani y cols., 1995). Por otra parte, los ácidos grasos poseen actividad detergente, de cuya acción sobre la membranas bacteriales puede resultar en una reducción de la producción de ácidos (Iwani y cols., 1995).

En nuestro trabajo se encontró que a pH 7,4 se requiere una concentración 3 mM de NK en el medio para reducir la producción de ácidos hasta un valor que representa aproximadamente 50% de inhibición (54,5%, p<0,05;n=5), Tabla 1. Haciendo salvedad de la diferencia de los agentes y sus vías de acción, la concentración de NK requerida para lograr un 50% de inhibición a pH 5,5 es marcadamente inferior a la correspondiente de NaF a pH 7,4 (tabla 2).

Se encontró que a pH 5,5 se requiere una concentración 0,26 mM de NK en el medio observándose una disminución en la producción de ácido. Se ha señalado que a pHs bajos la efectividad de los ácidos grasos se incrementa significativamente (Hayes, 1981), lo que pareciera estar ocurriendo en nuestras condiciones, basándose en que, independientemente de que el 50% de inhibición nominal a pH 5,5 no es debido parcialmente al NK, la concentración requerida fue sensiblemente inferior a la correspondiente a pH 7,4.

A pH 5,5 la concentración de NK (0,26 mM) necesaria para llevar la inhibición a 50% fue equivalente estadísticamente (p<0,05;n=5) a la de NaF (0,26 mM), lo que sugiere, dado lo diferente de estas concentraciones a pH 7,4, que la acidez del medio afecta en forma acusada la vía de acción del NaF.

Efecto de la mezcla Fluoruro de Sodio y Nonanoato de Potasio
Al analizar los datos obtenidos (expresados en µmol H+) en cuanto a la cantidad de ácidos producidos por las bacterias de la placa en presencia de los agentes combinados (NK+NaF) a pH 7,4 (Tabla 1 y 2), pudimos notar que ésta fue similar a la cantidad de ácidos producidos por el NK pero menor que el NaF. A pH 5,5 este patrón fue diferente. La mayor producción de ácidos correspondió a las muestras tratadas con la mezcla (NK+NaF) seguida por cantidades muy similares en los grupos tratados con los compuestos individualmente. Al evaluar los resultados obtenidos al mezclar el NK con el NaF a pH 5,5 observamos que el porcentaje de inhibición en la producción de ácidos fue significativamente mayor (50%) que la de los compuestos utilizados individualmente (NK=21%; NaF=29,1%). Esto sugiere que a este pH el NK y el NaF combinados actuaron de una manera acumulativa, esto puede significar que el efecto acumulado en cuanto a la reducción no fue mayor que la suma de los porcentajes de inhibición de ambos compuestos por separado. Esto pudiera ser una indicación de que las dos moléculas actúan de una manera independiente, el AG actuaría como agente surfactante sobre la membrana bacteriana y el NaF actuaría sobre las ATPasas de membrana incrementando de esta forma la efectividad de ambos compuestos, lo que reforzaría su utilización in vivo para disminuir la instalacion y el avance de las lesiones de caries dental.


Agradecimientos
Los autores quisiéramos agradecer a todas las personas que de una forma u otra hicieron posible llevar a cabo esta investigación, muy especialmente al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela por el soporte económico el cual permitió llevarla a feliz término y a la Cátedra de Clínica Infantil por habernos permitido al acceso a los niños atendidos en ese Servicio. Igualmente a la técnico Mariela Luna por su asistencia técnica, perteneciente al personal técnico del Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Odontología, U.C.V.