Trabajos Originales

Aislamiento, cultivo y diferenciación in vitro de células madre mesenquimales adultas de pulpa dentaria humana

Recibido para Arbitraje: 21/01/2015
Aceptado para publicación: 06/04/2015

    Camejo Suárez, Ma. V., Profesor Titular de la Cátedra de Endodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela. Merentes Díaz, E., Profesor Titular de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. Instituto de Biología Experimental, IBE. Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores. Payares Trujillo, G., Profesor Titular de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. Instituto de Biología Experimental, IBE. Laboratorio de Inmunología y Quimioterapia. Márquez, Ma. L., Profesor Asistente de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. Instituto de Biología Experimental, IBE. Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores. Espinoza Aliso, M., Profesor Asistente de la Cátedra de Anatomía Humana de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela

    CORRESPONDENCIA: valen_camejo@hotmail.com

    RECONOCIMIENTO: Queremos expresar nuestro agradecimiento al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH) de la Universidad Central de Venezuela por el apoyo financiero a través del Proyecto Individual: PI-7507-2009, necesario para llevar a cabo esta investigación. También quiero agradecer al Lic. José Torres, asesor estadístico, profesor del Instituto de Investigaciones Odontológicas "Raúl Vicentelli" de la Facultad de Odontología por el cálculo estadístico de los datos. Al Postgrado de Cirugía Bucal de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela por su colaboración en el suministro de las muestras (terceros molares) para llevar a cabo esta investigación.

AISLAMIENTO, CULTIVO Y DIFERENCIACIÓN IN VITRO DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES ADULTAS DE PULPA DENTARIA HUMANA

RESUMEN
Las células madre adultas tienen un gran potencial, para ser utilizadas en la terapia celular y la ingeniería de tejidos. El objetivo de este estudio fue establecer el cultivo de células madre mesenquimales adultas de la pulpa dentaria humana y determinar la capacidad de diferenciación, in vitro, hacia múltiples linajes con la utilización de medios inductores. Pulpas de 50 terceros molares retenidos, de 24 pacientes de 15 a 24 años, fueron removidas y procesadas. Para aislar las células, se utilizó el método de disgregación enzimática. Fueron cultivadas en medio DMEM-F12 (del inglés Medio Eagle´s Modificado por Dulbecco´s) suplementado con 15% de SFB, 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina y antibióticos-antimicótico. Se establecieron 8 líneas celulares de 8 pacientes diferentes. Las células fueron observadas diariamente. Se evaluó la morfología, la eficiencia de formación de colonias y la proliferación celular. Se indujo a la diferenciación odontogénica-osteogénica, condrogénica y adipogénica. Las células mesenquimales de pulpa dentaria aisladas, formaron colonias y la mayoría presentó una morfología típica de fibroblasto. Las células expresaron marcadores de células madre STRO-1, CD146 y no expresaron CD45 marcador específico de células hematopoyéticas. Mostraron capacidad de autorrenovación, eficiencia de formación de colonias y alta proliferación. Además fueron capaces de diferenciarse en múltiples linajes. En el presente trabajo de investigación se aislaron células mesenquimales de pulpa dentaria humana con características de células madre mesenquimales

PALABRAS CLAVE: Pulpa dentaria, Células madre de pulpa dentaria humana, Diferenciación in vitro



ISOLATION, CULTIVATION AND IN VITRO DIFFERENTIATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS FROM ADULT HUMAN DENTAL PULP

ABSTRACT
Adult stem cells have great potential, to be used in cell therapy and tissue engineering. The objective of this study was to establish culture of adult mesenchymal stem cells of the human dental pulp and determine the capacity of differentiation, in vitro, toward multiple lineages with the use of inductors media. Pulps of 50 impacted third molars, of 24 patients from 15 to 24 years, were removed and processed. To isolate the cells, we used the method of enzyme digestion. They were cultured in DMEM-F12 medium supplemented with 15% FBS, 100 ?m L-ascorbic acid 2-phosphate, 2 mm L-glutamine and antibiotic-antimycotic. Established 8 cell lines from 8 different patients. The cells were observed daily. We assessed the morphology, the efficiency of colony formation and cell proliferation. Was induced to odontogenic -osteogenic, chondrogenic and adipogenic differentiation . The mesenchymal cells isolated dental pulp, formed colonies and most presented a morphology typical of fibroblast. The cells expressed markers of stem cells STRO-1, CD146 and did not express CD45 specific marker for hematopoietic cells. Showed capacity of self renewal, efficiency of colony formation and high proliferation. In addition, they were able to differentiate into multiple lineages. In the present investigation were isolated mesenchymal cells of human dental pulp with characteristics of mesenchymal stem cells.

KEY WORDS: Dental pulp, Human dental pulp stem, Diferentiation in vitro


INTRODUCCIÓN

Las células madre son un grupo específico de células indiferenciadas que tienen un potencial proliferativo elevado y presentan dos características fundamentales: la capacidad de autorrenovación y la capacidad de generar uno o más tipos de células especializadas. Estas células han generado gran interés por su potencial en la medicina regenerativa. Las células madre mesenquimales son definidas como células multipotentes con el potencial para diferenciarse en osteoblastos, condroblastos y células adiposas y con la capacidad de autorrenovar su población por un tiempo relativamente largo. Estas células fueron aisladas inicialmente de la medula ósea1, y posteriormente han sido encontradas poblaciones semejantes a células madre mesenquimales en múltiples tejidos, tales como: tejido adiposo, cordón umbilical, líquido amniótico, sangre periférica, hueso, cartílago, tejido muscular y tejido pulpar. Las células madre mesenquimales de pulpa dentaria fueron aisladas por primera vez por Gronthos y col.2, en el 2000, de pulpa dentaria de terceros molares retenidos humanos y la mayor importancia de estas células es su capacidad de regenerar el complejo dentino-pulpar. Sin embargo, por su capacidad de diferenciarse hacia múltiples linaje, también podrían ser utilizadas en la regeneración de otros tejidos. Estas células exhiben características similares a las células madre mesenquimales de médula ósea,3 por lo que podrían ser consideradas como una alternativa más fácilmente accesible de células madre adultas. El objetivo de este estudio fue establecer el cultivo de células madre mesenquimales adultas de la pulpa dentaria humana y determinar la capacidad de diferenciación, in vitro, hacia múltiples linajes con la utilización de medios inductores.


MATERIALES Y MÉTODOS

1. MATERIAL BIOLÓGICO

1.1. Selección de pacientes y extracción dentaria

Se seleccionaron 24 pacientes jóvenes entre 15 y 24 años de edad, sanos, de ambos sexos, que acudieron a la Clínica de Especialidades Odontológicas CEOMED y al Servicio de Cirugía Bucal del Postgrado de Cirugía de la Facultad de Odontología de la UCV, a quienes se les extrajeron quirúrgicamente los terceros molares retenidos, por razones de tratamiento. Los pacientes dieron su consentimiento y el protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Odontología de la UCV. Una vez que los dientes fueron extraídos se colocaron inmediatamente en frascos estériles con medio de transporte para muestras humanas4. Bajo estas condiciones fueron llevados al Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores del Instituto de Biología Experimental de la Facultad de Ciencias de la UC V, para el aislamiento de las células madre de la pulpa dentaria humana.

1.2. Obtención de la muestra de tejido pulpar

En la campana de flujo laminar horizontal, los dientes se lavaron y desinfectaron 5-8. Posteriormente, se les realizó un surco de 0,5 a 1 mm de profundidad9 a 1 mm por debajo de la unión cemento-esmalte10. Bajo campana de flujo laminar vertical, los dientes se fracturaron con un cincel a nivel del surco realizado para exponer el tejido pulpar de la cámara5. El tejido pulpar se separó suavemente de la corona y la raíz10; en los casos de dientes con solo un tercio radicular formado, el tejido pulpar fue retirado por la raíz con zondas barbadas. Luego de retirado el tejido pulpar inmediatamente se colocó en una pequeña cantidad de medio DMEM-F12 frío, sobre una placa de Petri, sin permitir que se secara. Posteriormente, se cortó en trozos pequeños con tijera quirúrgica fina11.

2. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Para aislar las células, el tejido pulpar se colocó en una mezcla de solución enzimática de 4 mg/mL de colagenasa tipo I (SIGMA) y 2 mg/mL de dispasa (GIBCO™) en una proporción 1:1 por 60 minutos a 37°C. La suspensión obtenida se filtró a través de un filtro de células de 70 ?m y se centrifugó durante 6 minutos a 500 g, el taco celular obtenido, se resuspendió en el medio nutritivo para células mesenquimales12, compuesto por: medio DMEM-F12 suplementado con 15% de SFB (GIBCO™) 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato (Merck©), 2 mM L-glutamina (Glutamax; GIBCO©), 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL de anfotericina B (GIBCO®) y fueron sembradas en placas de 4 pozos [1,9 cm2 cada pozo, (NUNC)]. La viabilidad celular se determinó con el colorante de exclusión Azul Tripano y se cuantificó el número de células con un hemocitómetro (Cámara Neubauer). Los cultivos fueron incubados a 37°C, en atmósfera húmeda a un 95% de aire y un 5% de CO2. A las 24 a 48 horas se cambió el medio de cultivo, para eliminar los restos de células y células no adherentes13. Las células se mantuvieron hasta alcanzar la semiconfluencia (80%), con cambios periódicos de medio. Obtenida la semiconfluencia, se procedió a realizar los subcultivos con el fin de amplificar la población de células; para ello las células se disgregaron con tripsina (GIBCO™) a 0,05% y Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA - SIGMA©) a 0,2% 12, incubadas por 7 minutos a 37°C. Las células fueron centrifugadas a 500 g por 6 minutos y el taco celular obtenido se resuspendió en medio de cultivo nutritivo con suero, luego las células fueron contadas en una cámara de Neubauer para sembrar nuevamente.

2.1. Caracterización morfológica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana

Para analizar las características morfológicas y el comportamiento in vitro de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, se realizaron observaciones bajo el microscopio invertido de contrate de fases (Olympus I X50) acoplado a una computadora con programa TV Tuner y se tomaron los registros fotográficos correspondientes. El aspecto morfológico se determinó mediante coloración de rutina May-Grünwald-Giemsa.

2.2. Expresión de marcadores antigénicos de superficie celular para la identificación de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana a través del análisis inmunocitoquímico

Para observar si en las poblaciones de células aisladas y cultivadas in vitro, están presentes células mesenquimales con un fenotipo indiferenciado, se utilizó la expresión de marcadores de superficie característicos de estas células, por métodos inmunocitoquímicos. Los anticuerpos utilizados fueron el anti-STRO-1 y anti-CD146 (MUC18), dos marcadores tempranos de células madre mesenquimales y el anti-CD45, un marcador específico para células hematopoyéticas. Las células de los subcultivos, del tercer pasaje, de pulpa dentaria humana fueron sembradas a una densidad de 2 x 104 cel/cm2 en placas de 4 pozos y cultivadas durante la noche. Las células fueron lavadas con PBS, pH 7,4, luego se fijaron con metanol por 5 minutos. Se lavaron con Solución Buffer de Fosfato (PBS), seguidamente se agregó peróxido de hidrógeno al 3% por 6 minutos, para inactivar la peroxidasa endógena. Luego se lavó con PBS, para posteriormente realizar la incubación con el anticuerpo primario monoclonal mouse anti-STRO-1 (1:100; Invitrogen™), el anticuerpo monoclonal anti-CD146 (1:100; eBioscience) y el anticuerpo monoclonal mouse anti-humano CD45 (1: 100; Dako Denmark) por 35 minutos y se lavó con PBS, luego se evidenció la reacción del anticuerpo utilizando el Kit ABC (Vector), se colocó el anticuerpo secundario biotinilado por 30 minutos. Se incubó el complejo estreptavidina-HRP por 30 minutos, seguido del lavado con PBS, fresco. Seguidamente, se preparó el sustrato para la peroxidasa, la Diaminobencidina (cromógeno) y se incubó por 5 a 10 minutos. Se lavó con agua destilada, varias veces. Por último, se contrastaron los núcleos con Hematoxilina. El Kit ABC usa un anticuerpo secundario biotinilado que se une al complejo estreptavidina- biotina- peroxidasa, el cual reacciona con el sustrato para peroxidasa (Diaminobencidina) produciendo un precipitado marrón que permitió evidenciar la unión antígeno-anticuerpo6.

2.3. Determinación de la eficiencia de formación de colonias de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana

La eficiencia de formación de colonias se determinó en 8 pacientes (8 líneas celulares). Se utilizaron células del tercer subcultivo, las células se sembraron a baja densidad [30 cel 8,8 cm2 (placa de 35mm) y a 100 cel 8,8 cm2 (placa de 35mm)], por triplicado, en medio DMEM - F12, suplementado con 15% SFB, 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B. El medio nutritivo se cambió cada 4 días. A los 14 días, se realizó la evaluación de la eficiencia de la formación de colonias2,5,14. Los cultivos fueron fijados con metanol durante 5 minutos y se colorearon con Giemsa (diluido en una proporción 1: 15 con agua destilada). Grupos > 50 células se contaron como colonias2,15,16. Gronthos y col.15 en su estudio sobre la caracterización de alta pureza de las células madre mesenquimales de la médula ósea, los agregados > 50 células se contaron como unidades formadoras de colonias, mientras, que los agregados > 10 y < 50 células los contaron como racimos o grupos. De la misma manera fue considerado en la presente investigación. La eficiencia de formación de colonias se expresó en porcentaje, el número total de colonias se dividió entre el número inicial de células sembradas y el resultado se multiplicó por 100. Lo que indica el porcentaje de células capaces de formar colonias,14,17,18 la capacidad para autorrenovarse y la capacidad de propagación a baja densidad14.

3. DIFERENCIACIÓN, IN VITRO, HACIA LOS LINAJES ODONTOGÉNICO-OSTEOGÉNICO, CONDROGÉNICO Y ADIPOGÉNICO DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

3.1.-Diferenciación odontogénica-osteogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana

Las células aisladas de la pulpa dentaria del tercer subcultivo, de 3 líneas celulares (3 pacientes), fueron sembradas a 1.000 células por pozo en placas de 4 pozos en medio nutritivo para células mesenquimales, cultivadas a 37°C en atmósfera húmeda a un 5% de CO2, hasta lograr la semiconfluencia. Para inducir la diferenciación odontogénica-osteogénica, se añadió el medio inductivo compuesto por el medio nutritivo para células mesenquimales, más 10 mM/L de B-GP, 10 nmol/L de dexametasona y 50 µg/mL de ácido ascórbico fosfato8,19,20 y así lograr la diferenciación de las células cultivadas derivadas de la pulpa dentaria en células semejantes a odontoblastos20. Estas condiciones inducen la síntesis de matriz mineralizada de fosfato de calcio. Este medio es señalado como osteo-dentinogénico19. El medio fue cambiado 2 veces por semana, durante un período de catorce y veintiún días. El control, de la prueba de diferenciación consistió en las células cultivadas en ausencia del medio inductor20.

3.1.1. Evaluación de la diferenciación odontogénica-osteogénica

3.1.1.1. Caracterización morfológica

El aspecto morfológico se determinó mediante coloración de rutina May-Grünwald-Giemsa y con la técnica inmunocitoquímica donde se pudieron observar las características morfológicas de las células que expresaron la Sialoproteína Dentinaria (DSP).

3.1.1.2. Expresión de la DSP por medio del análisis inmunocitoquímico

La diferenciación odontoblástica se confirmó con el análisis inmunocitoquímico de la DSP (1:100; Santa Cruz Biotechnology Inc) 6,13,21. Los cultivos fueron examinados a los catorce y veintiún días para detectar la expresión de la DSP. Para llevar a cabo el marcaje, se siguió la metodología descrita anteriormente6,22.

3.1.1.3. Formación de nódulos de calcificación

Para detectar la formación de nódulos mineralizados se realizó la coloración histoquímica de depósitos de fosfato de calcio con colorante Rojo Alizarina23. Los cultivos fueron examinados a los catorce y veintiún días para detectar la formación de los nódulos mineralizados, utilizando el microscopio de luz2.

3.1.1.4. Actividad específica de la fosfatasa alcalina

La actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FA) esta asociada con la presencia de calcificaciones. La actividad cuantitativa de la FA fue determinada por la hidrólisis del sustrato p-nitrofenil fosfato (p-NPP), a p-nitrofenol (p-NP), luego del período de inducción odontogénica de catorce y veintiún días, de las células mesenquimales aisladas de la pulpa dentaria. El procedimiento fue el siguiente24, con algunas modificaciones: las células mesenquimales de la pulpa dentaria, del tercer pasaje, después de los catorce y veintiún días en cultivo, la capa de células fue lavada con PBS, separada, centrifugada y resuspendidas con PBS, se centrifugó y resuspendió en 1mL de tampón de lisis [10 mM TRIS-HCl (pH 7,4), 1 mM de fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF; inhibidor de proteasas), 0,05 mM de EDTA (sal sódica) y 0,1% Tritón X-100], luego fueron congeladas a (-20°C). Para la disrupción de la membrana celular, fueron congeladas (en nitrógeno líquido por 1min) y luego descongeladas, tres veces, posteriormente, centrifugadas a (2.800 g) a 4°C por diez minutos. La actividad de la FA fue determinada por la hidrólisis de 10 mM de p-nitrofenil fosfato (pNPP, PIERCE, Biotechnology, Inc., USA) como sustrato en 0,2 M de 2 amino-2-metil-1-propanol buffer (pH 9,5) a 37 °C, por cincuenta minutos. La reacción fue detenida añadiendo 0,8 mL de 0,5 N de NaOH. Se utilizó como control positivo un verme macho Schistosoma mansoni y como control negativo se utilizó el tampón de lisis sin muestra. La absorbancia se midió a 405 nm con un espectrofotómetro25,26 (UV-110-02 Shimadzu). Se determinó la concentración total de proteínas por el método de Lowry y col.27 empleando una curva de sero albumina de bovino. La actividad de la enzima fue expresada en µmol de p-nitrofenol por minuto por µg/mL de proteína total.

3.1.1.5. Determinación molecular inmunoquímica de la expresión del marcador de diferenciación odontoblástico DSP mediante electroforesis (SDS-PAGE) e inmunoblot (Western blot©)

El total de proteínas de las células cultivadas con medio inductivo odontogénico y sin medio inductivo durante treinta y veintiún días fueron extraídas mediante un proceso de congelación descongelación, previa colocación de inhibidor de proteasa (2mM de PMSF y 5mM EDTA). Luego fueron centrifugadas a 2.800g a 4°C, por quince minutos. Seguidamente, se cuantificó el total de proteínas mediante el método de Lowry y col. 27 y 5 µg de proteínas de cada muestra fue utilizado en 20 uL de volumen total. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE: de las siglas en inglés sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) a un 10%, de acuerdo con el protocolo de Laemmli.28 Las proteínas separadas en el gel se tiñeron con azul de Coomassie para revelar las bandas proteicas. Las proteínas separadas, también, fueron electrotransferidas a una membrana de nitrocelulosa usando voltaje constante, 100 V por una hora según protocolo de Towbin y col.29, con modificaciones. Después, la membrana fue bloqueada con [PBS-Tween 20 a un 0,1% y Polivinilpirrolidona (PVP) al 1%)] a temperatura ambiente por una hora. La membrana se incubó durante una hora con el anticuerpo primario anti-DSP a una dilución de 1:1000. Luego lavadas con solución de lavado (PBS-Tween 20 a un 1%) e incubadas con los anticuerpos secundarios anti-IgG de humano diluido en solución de bloqueo a 37 °C por una hora, se realizaron 3 lavados con solución de lavado y PBS. Luego se agregó el complejo ABC (Vectastain) y finalmente el complejo antígeno-anticuerpo fue revelado con una solución de Diaminobencidina30,31.

3.2.- Diferenciación condrogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana

Para inducir la diferenciación condrogénica, células del tercer pasaje, de 3 líneas celulares (3 pacientes), fueron sembradas a 1.000 cel/pozo, en placas de cultivo de 4 pozos, mantenidas en medio nutritivo para células mesenquimales hasta lograr la confluencia. Seguidamente se inició la preinducción por siete días, con el medio de cultivo específico para inducir la diferenciación condrogénica compuesto por medio nutritivo para células mesenquimales más 100 nmol/L dexametasona, 6,25 µg/mL insulina, 50 nmol/L ascorbato-2-fosfato, 110 mg/L piruvato de sodio8,32. Luego las células se disgregaron y centrifugaron, el taco celular se cultivó como una pequeña micromasa o agregado por otras dos semanas en el tubo para centrifuga de 15 ml 32. El medio fue cambiado dos veces por semana. Como control, se utilizó el medio nutritivo para células mesenquimales, sin medio inductor.

3.2. 1.Evaluación de la diferenciación condrogénica

3.2.1.1. Identificación de la secreción de proteoglicanos específicos de cartílago por medio de la coloración histoquímica con Azul Alciano

Para la evaluación histoquímica, la micromasa se fijó en 10% de formalina neutra y secciones embebidas en parafina (4-5 µm) fueron coloreadas con Azul Alciano21,33 que colorea la secreción de proteoglicanos específicos de cartílago13. Se utilizó solución de Azul Alciano pH 2,5. Se deshidrató, aclaró y montó, para ser observado al microscopio de luz.

3.2.1.2. Expresión de colágeno tipo II por medio del análisis inmunohistoquímico

La diferenciación condrogénica se confirmó con el análisis inmunohistoquímico del marcador colágeno tipo II, por técnica inmunohistoquímica.

3.3. Diferenciación adipogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana

Las células madre mesenquimales, según algunos autores5,10,14,33, bajo condiciones inductivas apropiadas, pueden diferenciarse en adipocitos con presencia de vacuolas de contenido lipídico en su citoplasma. Para inducir la diferenciación adipogénica, después del tercer pasaje, las células de 3 líneas celulares (3 pacientes), fueron sembradas a 1.000 cel/pozo, en placas de cultivo de 4 pozos, en medio nutritivo para células mesenquimales hasta lograr la semiconfluencia. Posteriormente, las células fueron incubadas en medio inductivo adipogénico, compuesto por el medio nutritivo para células mesenquimales suplementado con 0,5 mM isobutil-metilxantina, 0,5 µM hidrocortisona, 60 µM indometacina y 10 µg/mL de insulina. Los cultivos fueron colocados en incubadora a 37°C, en atmósfera húmeda al 5% de CO2 por tres semanas, el medio fue cambiado cada dos ó tres días por semana5,12. Como control, se utilizó el medio nutritivo para células mesenquimales sin medio inductivo12.

3.3. 1. Evaluación de la diferenciación adipogénica

3.3.1.1. Caracterización morfológica y formación de vacuolas de lípidos mediante coloración histoquímica con Sudan III

Se observaron las características morfológicas de las células inducidas a la diferenciación adipogénica y la formación de vacuolas de lípidos mediante coloración histoquímica con el Sudan III 34. Para realizar la coloración, al finalizar el período de cultivo, las células se fijaron en 10% de formalina neutra durante diez minutos. Una vez realizada la fijación, se realizó la coloración con el colorante Sudan III (SIGMA-ALDRIACH©)


RESULTADOS

1. AISLAMIENTO, CULTIVO Y CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Bajo las condiciones de aislamiento y cultivo llevadas a cabo en la presente investigación se establecieron células viables de la pulpa dentaria humana, evidenciado a través del contaje celular y la observación regular de los cultivos, con un microscopio invertido de contraste de fase. Las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, de terceros molares, mostraron un óptimo crecimiento, cultivadas en el medio DMEM-F12, suplementado con 15% de SFB, 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina y 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B. El aspecto morfológico y el comportamiento in vitro de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana mostraron, en el cultivo primario, que las células aisladas formaron colonias adherentes a partir de los 3 a 5 días, la mayoría de las células presentaron una morfología fusiforme típica de células semejantes a fibroblastos. A partir del tercer subcultivo, se obtuvo una población más homogénea, basado en la morfología de las células, características de células semejantes a fibroblastos con extensiones citoplasmáticas, núcleo ovalado, central con varios nucléolos, que permanecieron hasta el decimoctavo pasaje. Se pudo evidenciar que la mayor proliferación celular se observó entre el sexto y octavo subcultivo. En el sexto y séptimo subcultivos además de la gran proliferación celular, se observó la formación de agregados de células. Las células cercanas al agregado celular se observan estrechamente unidas y pierden su morfología fusiforme y adquieren una morfología cuboidal, posiblemente asociado a una diferenciación espontánea hacia el linaje osteogénico. Mientras que en el resto del cultivo las células conservaron su morfología fusiforme semejante a fibroblastos. En los siguientes subcultivos no se observaron aparentemente cambios morfológicos de las células asociados a la diferenciación y senescencia.

2. EXPRESIÓN DE MARCADORES ANTIGÉNICOS DE SUPERFICIE CELULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA A TRAVÉS DEL ANÁLISIS INMUNOCITOQUÍMICO

La identificación de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana a través del análisis inmunocitoquímico de los cultivos de células mesenquimales de la pulpa dentaria, se realizó utilizando los anticuerpos anti-STRO-1, anti-CD146/MUC18 y el anti-CD45. Las células aisladas de la pulpa dentaria de terceros molares, del tercer pasaje, expresaron moléculas de superficie celular STRO-1 (marcador de células mesenquimales) y CD146 (marcador de células endoteliales) "positivas", considerados dos marcadores tempranos de células madre mesenquimales mientras, el marcador específico para células hematopoyéticas, el CD45 (antígeno común de leucocitos) fue "negativo". Estos resultados fueron consistentes para las distintas líneas celulares. Las células que expresan las moléculas de superficie STRO-1 y CD146 en las poblaciones de células aisladas, mostraron una expresión diferencial en la intensidad de reacción, que se estableció de manera subjetiva. Los marcadores no se expresaron uniformemente, sino en subgrupos de células, lo que indica que la población de células madre de pulpa dentaria es heterogénea. El porcentaje aproximado de células que expresaron el STRO-1 varió entre un 7% y un 10%, exceptuando la línea celular 1, que presentó colonias con un 87% de células marcadas. El porcentaje de células que expresaron CD146 varió entre un 8% y un 22%, exceptuando la línea 1, que presentó colonias con un 97% de células marcadas. La morfología de las células que expresaron STRO-1 y CD146 varió entre fusiforme y células con amplio citoplasma.

3. DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE FORMACIÓN DE COLONIAS DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

En los cultivos en monocapa de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas, las células fueron capaces de formar colonias a baja densidad. Las colonias estaban formadas por numerosas células adherentes, fusiformes. Lo que demostró su capacidad de renovación y eficiencia de formación de colonias. Sin embargo, la eficiencia de formación de colonias expresada en porcentaje, varió entre las diferentes líneas celulares. Las líneas celulares que se sembraron a una densidad de 30 células por placa de 35 mm, fueron muy escasas o no formaron colonia ? 50 células, y al calcular la eficiencia de formación de colonia se obtuvieron los siguientes resultados 2,2%, 0%, 1,1%, 0% de células capaces de formar colonias, además, formaron agregados de 10 a 30 células. Mientras, que las líneas celulares sembradas a una densidad de 100 células por placa de 35 mm formaron un número mayor de colonias ? 50 células, y al calcular la eficiencia de formación de colonias se obtuvieron los siguientes resultados 15,6%, 42% de células capaces de formar colonias además de los agregados de 10 a 40 células y una línea celular que formó una monocapa.


4. DIFERENCIACIÓN ODONTOGÉNICA-OSTEOGÉNICA, CONDROGÉNICA Y ADIPOGÉNICA DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

4.1. Diferenciación odontogénica-osteogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana

4.1.1. Caracterización morfológica. Con la coloración May-Gru?nwald-Giemsa, a los catorce días de "inducción" se observaron células con morfología fibroblástica, dispuestas paralelas unas a otras. A los veintiún días de "inducción", se observó mayor número de células, estrechamente unidas, dispuestas paralelas unas a otras y algunas células presentaron cambios morfológicos;

4.1.2. Expresión inmunocitoquímica de la DSP. A los catorce días, en el cultivo "control", no se observó expresión de la DSP (Figura 1A), mientras, que en los cultivos "inducidos a la diferenciación odontogénica-osteogénica" se evidenció la expresión inmunocitoquímica moderada e intensa de la DSP, en algunas zonas del cultivo (Figura 1B y C). A los veintiún días, en el cultivo "control" se observó expresión de la DSP de leve a moderada y algunas células presentaron cambios morfológicos hacia la diferenciación, con características semejantes a odontoblastos (Figura 2A, B y C). En los cultivos "inducidos a la diferenciación odontogénica-osteogénica" hubo mayor expresión de la DSP y mayor número de células con morfología semejantes a odontoblastos (células polarizadas, núcleo excéntrico y formación de un proceso celular) (Figura 2D, E y F). Lo que indica que algunas células mesenquimales de la pulpa dentaria cultivadas en monocapa expresaron un fenotipo semejante a odontoblastos.

FIGURA 1
Diferenciación odontogénica-osteogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, cultivo en monocapa. Expresión inmunocitoquímica de la DSP (Coloración marrón). Catorce días de inducción. A. Cultivo "control", no hay expresión. 400x. B. Cultivo "inducido a la diferenciación odontogénica-osteogénica", expresión moderada e intensa de la DSP (flechas). 200x. C. Detalle de las células que expresan la DSP (flechas). 400x

FIGURA 2
Diferenciación odontogénica-osteogénica de las células mesenquimales de pulpa dentaria humana, cultivo en monocapa. Expresión inmunocitoquímica de la DSP y cambios morfológicos de las células. Veintiún días de inducción. Cultivo "control": A. y B. Algunas células expresan leve y moderado DSP+ (flechas). 400x. C. Cambios morfológicos, célula semejante a odontoblasto (*). 400x. Cultivo "inducido a la diferenciación odontogénica-osteogénica": D. Agregado celular DSP+ (flecha). 40x. E. Mayor aumento, células y matriz expresan DSP+ (flechas). 200x. F. Células con morfología semejante a odontoblastos, núcleo polarizado (N), proceso odontoblástico alargado (P), expresan DSP+.

4.1.3. Formación de nódulos calcificados. Las observaciones realizadas a los cultivos "inducidos
a la diferenciación odontogénica-osteogénica" revelaron la formación de múltiples nódulos. Estos nódulos fueron coloreados histoquímicamente con Rojo Alizarina, que colorea la matriz
mineralizada depositada por las células. A los catorce días, en el cultivo "control" hubo presencia unos pocos y pequeños nódulos redondeados (Figura 3A). En los cultivos "inducidos a la diferenciación odontogénica-osteogénica", se observó la presencia de mayor número de nódulos de calcificación redondeados (Figura 3B y C). A los veintiún días, el cultivo "control" mostró la presencia de un mayor número de nódulos calcificados, que en el cultivo "control" a los catorce días (Figura 3D). En los cultivos "inducidos a la diferenciación" a los veintiún días, se observaron numerosos y grandes focos de calcificación que confluían. (Figura 3E y F). De esta manera se confirma el potencial de las células de la pulpa dentaria de formar depósitos calcificados, in vitro. Estos resultados se observaron en las tres líneas celulares evaluadas.

FIGURA 3
Diferenciación odontogénica-osteogénica de las células mesenquimales de pulpa dentaria humana, cultivo en monocapa. Formación de nódulos calcificados, coloración histoquímica con Rojo Alizarina. Catorce días: A. Cultivo "control", se observa la formación de muy pocos y pequeños nódulos. 100x. B. Cultivo "inducido a la diferenciación odontogénica-osteogénica", formación de mayor número de nódulos calcificados y de mayor tamaño. 40x. C. Características de estos nódulos a mayor aumento.100x. Veintiún días: D. Cultivo "control", se observan numerosos nódulos calcificados. 100x. E. Cultivo "inducido a la diferenciación odontogénica-osteogénica", numerosos nódulos pequeños, grandes y zonas difusas de mineralización. 100x. F. Mayor detalle de estos nódulos y zonas de mineralización. 200x.

4.1.4. Actividad específica de la FA. El análisis de los datos de la actividad específica de la FA, según el tiempo de "inducción odontogénica-osteogénica", catorce y veintiún días, se realizó en dos líneas celulares (7 y 8), por triplicado. Los resultados mostraron que a los catorce días de "inducción", en la línea celular 7, no se observó un aumento de la actividad de la enzima con respecto al "control", sin embargo, a los veintiún días fue evidente el aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina con respecto al "control". Mientras, en la línea 8, tanto a los catorce días como a los veintiún días de "inducción" se evidenció el aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina con respecto al "control". El aumento de la actividad de la enzima podría significar una mayor mineralización de la matriz, puesto que la FA promueve la secreción de matriz para formar nódulos mineralizados. Además, pudiera indicar la diferenciación de las células mesenquimales de la pulpa en odontoblastos funcionales, pues se considera un marcador temprano de diferenciación. Grafico 1

4.1.4. Determinación molecular inmunoquímica de la expresión del marcador de diferenciación odontoblástico DSP mediante electroforesis (SDS-PAGE) e inmunoblot (Western blot). En la figura 4, se observa que los patrones electroforéticos de las tres líneas celulares (6, 7, 8) fueron muy parecidos. Los carriles correspondientes a las células inducidas (Od) y sus controles (C), muestran una proteína dominante de peso molecular (Mr) 40,6 kDa que se aprecia a todo lo ancho del gel. Sin embargo, claras diferencias en los perfiles de proteínas son mostrados principalmente a los treinta días de la inducción. Así, dos polipéptidos de Mrs 165,4 y 98,2 se aprecian ligeramente teñidas, mientras, tres polipéptidos dominantes de Mrs 69,4; 30,5 y 18,0 fueron detectadas, junto con la sobre expresión de la proteína de Mr 40,6 kDa que se manifiesta como una banda muy ancha que se extiende a niveles más bajos de peso molecular, en los carriles 2 y 7. Estos carriles corresponden a la línea celular 7, evaluada a los treinta días de la inducción odontoblástica. La fuerte dominancia de la proteína 40,6 kDa observada en los carriles 2 y 7, sugiere una mayor expresión de esta proteína como consecuencia de la inducción odontoblástica a mayor tiempo de cultivo (treinta días). La figura 5 muestra los resultados obtenidos al enfrentar el espectro de proteínas separadas mediante SDS-PAGE e inmovilizadas en papel de nitrocelulosa a una sonda inmunológica altamente específica con la proteína DSP. Tres proteínas de Mrs 147,0; 95,4 y 79,4 (carril 2) fueron reconocidas específicamente por el anticuerpo anti-DSP en las proteínas extraídas de las células de la línea 7, inducidas a la diferenciación odontogénica-osteogénica y cultivadas durante treinta días. El anticuerpo no detectó polipéptidos antigénicos en las proteínas extraídas de las células no inducidas (control, carril 3), cultivadas durante el mismo tiempo. En las líneas celulares 6 y 8, inducidas a la diferenciación durante veintiún días de cultivo, solo la proteína de Mr 95,4 kDa fue ligeramente reconocida por el anticuerpo anti-DSP, mientras que, en los cultivos no inducidos (controles) durante el mismo tiempo (veintiún días) no fue detectada (no mostrado).

4.2. Diferenciación condrogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana

Las secciones preparadas de los agregados o micromasas de células mesenquimales de pulpa dentaria humana, "inducidas a la diferenciación condrogénica" por tres semanas, revelaron la
diferenciación condrogénica, a través de la secreción de proteoglicanos sulfatados específicos de cartílago en la matriz extracelular, coloreados histoquímicamente con Azul Alciano pH 2,5. Los agregados o micromasas muestran una estructura compacta donde se observan los núcleos de las células, la matriz extracelular que rodea las células y en la periferia una capa de células fusiformes que lo rodea análoga al "pericondrio (Figura 6). La diferenciación, hacia el linaje condrogénico, fue confirmada por la expresión inmunohistoquímica "positiva" del anticuerpo anticolágeno tipo II en algunas células y la matriz extracelular (Figura 7). Los resultados en el control y condiciones de diferenciación fueron iguales en las tres líneas celulares evaluadas.

Gráfico 1
Actividad específica de la FA de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana a los catorce y veintiún días de inducción odontogénica-osteogénica, en dos líneas celulares
* una muestra (no inducida a la diferenciación odontogénica-osteogénica),
* otriplicado (inducidas a la diferenciación odontogénica-osteogénica)

FIGURA 4
Patrón electroforético (SDS-PAGE) de las proteínas extraídas de las células mesenquimales de pulpa dentaria humana, veintiún y treinta días después de la inducción a la diferenciación odontogénica. Carril 1, Marcador de peso molecular. (kDa: Kilodaltons);. Carril 2 y 3, línea celular 7, inducida (2) y su control (3), 30 días de inducción. Carril 5 y 6, línea celular 8, inducida (5) y su control (6), 21 días de inducción. Carril 4 y 8, línea celular 6, control, (4) e inducida (8), 21 días de inducción. Carril 7, igual al carril 2. Gel de 10% acrilamida teñido con azul de Comassie

FIGURA 5
Identificación específica de proteínas DSP mediante electrotransferencia a papel de nitrocelulosa e inmunoreconocimiento con suero anti-DSP (inmunoblot). Carril 1, Marcadores de peso molecular. Carril 2, Proteínas extraídas de la línea celular 7 a treinta días de inducción. Carril 3, Control línea celular 7 (No inducida). Tres polipéptidos fueron reconocidos por los anticuerpos del suero anti-DSP. (Pesos moleculares relativos: Mr 147 kDa, 95,4 kDa y 79, 4 kDa están indicados a la derecha de la figura)

FIGURA 6
Inducción a la diferenciación condrogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, por tres semanas. Coloración histoquímica con Azul Alcián pH 2,5. A. Cultivo "control": la micromasa, fue "negativa" a la coloración histoquímica con el Azul Alcián. 100x. B. Cultivo "inducido a la diferenciación": la micromasa, fue "positiva" a la coloración con el Azul Alcián. 40x. C. Zona central, se detalla la matriz extracelular coloreada con el Azul Alcian(*) que revela la producción de glicosaminoglicanos sulfatados componente de la matriz de cartílago y los núcleos de las células (flecha).400x. D. Periferia de la micromasa, coloreada azul intenso, se observan células fusiformes cortas que rodean la micromasa semejante al "pericondrio". 400x. (flechas)

FIGURA 7
Inducción a la diferenciación condrogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, por tres semanas. Expresión del anticuerpo anticolágeno tipo II, prueba inmunohistoquímica (coloración marrón). A. Cultivo "control", el anticuerpo no se expresa. 200x. B. Cultivo "inducido a la diferenciación", agregado o micromasa. 40x. C. Mayor aumento, zona periférica expresión positiva en algunas células y en la matriz extracelular. 400x. D. Zona central, algunas células (flechas) y zonas de la matriz ( ) expresan el anticuerpo anticolágeno tipo II. 400x

4.3. Diferenciación adipogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana

La evaluación del potencial de diferenciación hacia el linaje adipogénico de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana se realizó después de una semana (una línea celular) y tres semanas (2 líneas celulares) de cultivo con el cóctel inductivo descrito anteriormente y se evidenció con la coloración histoquímica, con Sudan III. Los cultivos Sudan III "positivos" se identificaron con vacuolas de lípido observadas bajo el microscopio óptico de luz, que permitió determinar la diferenciación hacia adipocitos. Las células cultivadas en monocapa y tratadas con suplementos adipogénicos por una semana presentaron la característica de preadipocitos, que comienzan a acumular gotas de lípido en su citoplasma (Figura 8 A y B). En las células cultivadas por tres semanas, la morfología de las células mesenquimales de la pulpa dentaria cambió de una morfología fibroblástica alargada a una morfología redondeada con lípido en su citoplasma. En el cultivo "control" las células mesenquimales no presentaron cambios morfológicos ni presencia de gotas de grasa. Figura 8C y D

FIGURA 8
Inducción a la diferenciación adipogénica de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana cultivadas en monocapa. Una semana: A. Cultivo "control": células con morfología fusiforme, núcleo ovalado y central, varios nucléolos y delgadas prolongaciones citoplasmáticas. 400x. B. Cultivo "inducido": células tratadas con suplementos adipogénicos por una semana, presentan características de preadipocitos, células con morfología poligonal con gotas de lípido en el citoplasma coloreadas con Sudan III, (flechas). 400x. Tres semanas. C. Cultivo "control", células fusiformes, con morfología típica de fibroblastos. 400x. D. Células "inducidas a la diferenciación adipogénica", las células tienen una forma esférica, algunas positivas a la coloración histoquímica con Sudan III (flechas). 400x

DISCUSIÓN

El objetivo de esta investigación fue establecer el cultivo de células madre mesenquimales adultas de pulpa dentaria humana y determinar su capacidad de diferenciación, in vitro, hacia
múltiples linajes con la utilización de medios inductores. El mayor obstáculo para el establecimiento exitoso del cultivo de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana
fue la desinfección de los dientes para prevenir la contaminación. Trece de 24 cultivos (54,1 %), de 24 pacientes diferentes sufrieron contaminación microbiana. Esto demostró la
importancia de las condiciones de la toma de la muestra (dientes extraídos), así como, del proceso de desinfección de la superficie dentaria, previa obtención del tejido pulpar. En este sentido, sería beneficioso el enjuague de la cavidad bucal con solución tópica bucal gluconato de clorhexidina al 0,12%, antes de la extracción dentaria para reducir la cantidad de microorganismos al momento del procedimiento quirúrgico. D´Aquino y col. 16,35 recomiendan que una semana antes de la extracción de los dientes se realice una higiene bucal profesional. En lo que se refiere al protocolo para la desinfección de los dientes, una vez extraídos, incluía el lavado con PBS y la desinfección con alcohol al 70% 6-8,36. Sin embargo, Perry y col.37 recomiendan un protocolo adaptado del banco de cornea, que consiste en el lavado de los dientes varias veces con PBS, luego sumergirlos en un 1% de povidine-iodo, posteriormente sumergirlos en un 0,1% de tiosulfato de sodio en PBS, y luego nuevamente en PBS, para remover las bacterias. Por otro lado, D´Aquino y col.16,35 realizan el lavado de los dientes con una solución de clorhexidina al 0,2%, mientras que, Trino y col.38 recomiendan cubrir la corona con gel de clorhexidina al 0,3% por 2 minutos. Sería recomendable realizar un estudio para determinar la efectividad de cada uno de los protocolos.

Para el aislamiento de las células mesenquimales de la pulpa dentaria, la mayoría de los investigadores 8,9,11-13,17,21,23,39,40-46 utilizan el método de disgregación enzimática, descrito por Gronthos y col.2 Igualmente, en el presente estudio se seleccionó este método, porque se consigue un gran número de células aisladas en corto tiempo y más representativo del tejido, que con las técnicas por explantes.47,48 De Souza y col.49 señalan que ambos métodos son efectivos para la obtención de las células, pero las células obtenidas por disgregación enzimática presentaron un alto potencial proliferativo y mayor rendimiento comparado con el método por explante. Mientras, Hilkens y col.50 no observaron diferencias entre los dos métodos. Se utilizó una combinación de enzimas2 basado en las características histológicas del tejido.

Para el cultivo de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria la mayoría de los investigadores 5,8,12-14,17,24, 41,51-53 utilizan el medio ?-MEM propuesto por Gronthos y col.2 También, es ampliamente utilizado el medio DMEM 1,11,40,42,54-56, con el que, igualmente, se obtiene un óptimo crecimiento celular. En el presente estudio se utilizó el medio DMEM-F12 que también proporciona buenos resultados9 y se ha utilizado en el laboratorio, en el protocolo para el cultivo de otros tipos de células4,57,58. Sin embargo, Govindasamy y col.58 señalan que la tasa de proliferación es significativamente alta en los medios a-MEM y DMEM comparado con el medio DMEM-F12 y el DMEM-LG. En la presente investigación las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, de terceros molares, mostraron un óptimo crecimiento, cultivadas en medio DMEM-F12, suplementado con 15% de SFB, 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina y 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B.

Las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas mostraron la morfología típica de fibroblastos, lo que coincide con numerosos investigadores2 ,6,7,41,48 y es análoga a la progenie de la médula ósea humana2. Se observaron células fusiformes, con finas extensiones citoplasmáticas, también, células con un amplio citoplasma y extensiones citoplasmáticas. Por su parte, Suchánek y col.36 señalan que las células madre de la pulpa dentaria aisladas del compartimiento perivascular eran fusiformes con procesos alargados, mientras que, las células del compartimiento subodontoblástico eran más redondeadas. En nuestro caso, no se puede saber específicamente de que zona provenían las células identificadas como células madre, sin embargo, en los cortes de la muestra de tejido pulpar preparados se identificaron estas células en la zona perivascular. Lo que coincide con lo descrito en otros estudios41,59. En las líneas celulares que se sometieron a más de 6 subcultivos, se observó la presencia de algunos agregados celulares. Las células cercanas al agregado mostraron cambios morfológicos, de morfología fusiforme a cuboidal y oval, sugerentes a una posible diferenciación espontánea. La diferenciación espontánea de las células madre de la pulpa dentaria sin añadir un medio inductor ha sido descrita por Alliot-Licht y col.25, también, por Tsukamoto60 y recientemente, por Yu y col.61 Este proceso de diferenciación espontánea pudiera deberse a la presencia de células progenitoras comprometidas, que se diferencian hacia una vía particular de desarrollo celular62.

Para el análisis de la expresión de antígenos de superficie de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, a través de técnicas inmunocitoquímicas, para demostrar la presencia de células madre mesenquimales en la población de células aislada, se seleccionaron los anticuerpos anti-STRO-1, anti-CD146 y anti-CD45, que actúan como marcadores de células madre mesenquimales. Los resultados mostraron que las células aisladas de pulpa dentaria, del tercer pasaje expresaron moléculas de superficie celular STRO-1 y CD146 “positivos”, también presentes en estudios previos en células madre mesenquimales de médula ósea y en células madre de pulpa dentaria humana de dientes permanentes2,63,64 y en dientes primarios exfoliados.41 El porcentaje de células que expresaron estos marcadores varió entre las líneas celulares evaluadas. Esta diferencia se pudiera explicar porque se trata de una población heterogénea de células, la presencia de subpoblaciones en diferentes estado de diferenciación, quizás la línea 1 representa una población de células más homogénea. Se podría pensar, también, en la variabilidad entre los donadores. Estos aspectos son señalados por Hilkens y col. 50 La expresión del marcador de células perivasculares CD146 soporta la localización de las células madre mesenquimales en el nicho perivascular de la pulpa dentaria, como lo demostraron Shi y Gronthos59. Se ha observado que ambos anticuerpos anti-STRO-1 y anti-CD146 marcan las mismas poblaciones celulares precursoras65. La ausencia de expresión del marcador específico para células hematopoyéticas, el CD45, indica que en las células aisladas de la pulpa dentaria, no están presentes progenitoras hematopoyéticas,43 que coincide con los resultados de otras investigaciones2,5,8,43. Se demuestra que estas células no derivan de fuentes hematopoyéticas sino son de origen mesenquimal. Se pudiera considerar la identificación de células madre mesenquimales en las poblaciones de células aisladas de pulpa dentaria humana.

Una de las propiedades que define las células madre es su potencial de autorrenovación, la capacidad de generar copias idénticas de ellas mismas. En la determinación de la eficiencia de formación de colonias de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana se observó una estrecha relación entre el número de células cultivadas y el número de colonias fibroblásticas que se desarrollaron, esto coincide con las observaciones realizadas por Friedenstein30, en el cultivo de células mesenquimales de médula ósea. La formación de colonias ocurre solo cuando la siembra se desarrolla a una cierta densidad inicial óptima de células, en caso de excesivo número de células por unidad de superficie, los fibroblastos forman una monocapa, mientras, en el caso de insuficiente densidad, ellas fallan en crecer. Se observó, también, que la eficiencia de formación de colonias, expresada en porcentaje, de las líneas celulares establecidas de células mesenquimales de la pulpa dentaria mostraron la capacidad de formar colonias y una capacidad de autorrenovación variable que coincide con las observaciones realizadas en células mesenquimales de la médula ósea y se explica por que hay subpoblaciones en diferentes estados de diferenciación66.

Otra característica de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana es que son células multipotentes, cuya diferenciación esta modulada por el medio ambiente local donde habitan30. Las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana no fueron específicamente seleccionadas, metodología que coincide con la desarrollada en otras investigaciones2,51. Sin embargo, en otros estudios se han identificado y seleccionado células madre que expresan5,41,67 y coexpresan marcadores de células madre43 para su diferenciación. En este sentido, Yang67 evaluó el potencial de diferenciación de células seleccionadas y no seleccionadas y observó que se diferencian de manera similar, no obstante, en los cultivos de las células seleccionadas STRO-1+, el potencial de diferenciación fue más definido, quizás por ser una población de células más homogénea.

In vivo, la diferenciación de los odontoblastos durante el desarrollo dentario, depende de la interacción reciproca del epitelio y el mesenquima dentario, en la que numerosas moléculas señalizadoras y factores de crecimiento están asociadas68-70. Los odontoblastos diferenciados secretan la dentina primaria, secundaria y terciaria reaccionaria. Mientras que, en los procesos de reparación, en el que los odontoblastos postmitóticos han muerto, las células semejantes a odontoblastos polarizados o de reemplazo, que se han diferenciado en ausencia del epitelio dentario y la membrana basal dan origen a la dentina terciaria reparativa71. Se cree que los factores de crecimiento presentes en la matriz de dentina pueden ser liberados y contribuir en la señalización de los eventos de reparación70. En la presente investigación, in vitro, las células mesenquimales de la pulpa dentaria aisladas se “indujeron a la diferenciación odontogénica-osteogénica” bajo condiciones de cultivo específicas descritas en materiales y métodos. literatura16,25,60. La polarización de las células y la apariencia de un proceso celular son las principales características morfológicas de los odontoblastos en diferenciación terminal, asociada con la expresión de proteínas específicas de la dentina. Los odontoblastos jóvenes inicialmente expresan la DSP, cuando ellos comienzan a secretar predentina72. En la presente investigación, a los veintiún días, se observaron células con estas características morfológicas, que expresan inmunocitoquímicamente la DSP, que indica la diferenciación de las células madre mesenquimales hacia el linaje odontogénico, en cultivos en monocapa. Asimismo, Couble y col.73 describen que a las cinco a seis semanas de cultivo, las células exhibían una posición excéntrica del núcleo y algunas de ellas tenían procesos alargados. Además, las células se alineaban con su proceso orientado en igual dirección y en algunos casos desarrollaron uniones complejas. Presentaron una organización espacial similar a la capa de odontoblastos. En el presente estudio se desconoce la respuesta a un mayor tiempo de inducción, para poder evidenciar esta organización. Se ha descrito, en otros estudios, que en los cultivos de las células de la pulpa dentaria se incrementa la expresión de la proteína DSP, después de los catorce días de cultivo6,25,26,73. Esto coincide con los resultados obtenidos en el presente estudio. Además, indican que subpoblaciones heterogéneas contienen células madre o progenitoras del linaje odontoblástico caracterizadas por la reacción “positiva” a la DSP.

En esta investigación, las células en los cultivos “inducidos a la diferenciación” a los catorce y veintiún días formaron nódulos mineralizados. Lo que coincide con otras investigaciones.6,25 La presencia de múltiples nódulos calcificados a los veintiún días de “inducción”, evidenciados con Rojo Alizarina, coincide con lo descrito por otros investigadores8,39,42,74. Algunos autores2,42,60,73 señalan que el potencial odontogénico de las células de la pulpa dentaria se describe a través de la formación de depósitos calcificados, en sistemas de cultivo, in vitro. La actividad de la FA es un indicador importante de odontoblastos funcionales24 y juega un papel importante en la iniciación de la formación de tejido mineralizado. Se utiliza, frecuentemente, como marcador, durante la diferenciación inicial, de los odontoblastos, in vitro44. El aumento progresivo de la actividad específica de la FA entre los catorce y veintiún días de la “inducción a la diferenciación odontogénica-osteogénica” coincide con los resultados de otros autores8,24,74.

Por otro lado, la expresión bioquímica de la DSP a los veintiún días y treinta días de “inducción” puede indicar que las células mesenquimales de pulpa dentaria humana con apariencia semejante a odontoblastos pudieron ser capaces de sintetizar y secretar esta proteína.

En la electroforesis (SDS-PAGE) se observó el predominio de una proteína de peso molecular Mr 40,6 kDa, sin embargo a los 30 días de inducción se detectaron otras proteínas de Mr (165,4; 98,2; 69,4; 30,5 y 18,0 kDa). Butler y col.75 describen una banda ancha entre 160 y 210 kDa, de una preparación parcialmente purificada de DSPP, fue reconocida por inmunoblot con el anti-DSP. Se pudiera sugerir, que la proteína de Mr 165,4 corresponda a la DSPP. La DSPP es el precursor inactivo de la DPP y la DSP, para su división y liberación se requiere de un proceso de proteólisis. La siguiente banda ubicada a un peso molecular de Mr de 98,2 se pudiera especular que corresponda a la DSP de 95 kDa76 aunque se aleja un poco del valor, también, se pudiera sugerir que la proteína Mr 40,6 pudiera corresponder al reconocimiento de la OPN de peso molecular cercano a 41,5 kDa72. Sin embargo, solo a través de estudios con anticuerpos específicos permitiría la identificación de estas proteínas. Se podría esperar la presencia de colágeno tipo I, trímero tipo I, tipo III, además, de las proteínas fosforiladas, como lo describen Kasugai y col.45 al inducir la diferenciación de células de la pulpa de ratas. Goldberg y Smith77 señalan que las células de la pulpa en cultivo expresan colágeno tipo I y III, OSN, OPN, FN y FA, pero no DPP o DSP. Sin embargo, la expresión de la DSP y otras moléculas consideradas como marcadores específicos de odontoblastos, indica que durante el cultivo puede ocurrir una transformación espontánea del fenotipo de las células. En iguales condiciones, tal como la adición de -GP, células de la pulpa podrían formar nódulos mineralizados y expresar marcadores odontoblásticos. Lo que coincide con los resultados obtenidos en la presente investigación.

La expresión de la DSP por técnica de inmunoblot, a los treinta días de la “inducción odontogénica” en la línea celular 7, reconoció específicamente tres bandas de polipéptidos de Mrs 147,0; 95,4 y 79,4 kDa, identificadas con un anticuerpo policlonal anti-DSP. Lo que indica que más de una sola proteína DSP puede existir72. A los veintiún días de la “inducción odontogénica” en las líneas celulares 6 y 8, la DSP solo se expresó y reconoció levemente en una sola banda, de Mr 95,4 kDa. En otras investigaciones la DSP se ha detectado por inmunoblot como una banda de Mr de 95 kDa72,78 y Mr de 53 kDa79 en extractos de proteínas de células de la pulpa de ratas, inducidas a la diferenciación; y de extractos de proteínas de células madre mesenquimales de pulpa dentaria humana80. Butler y col.72 describen que la DSP de dentina de ratón ocurre en dos formas de Mr 100 kDa y 75 kDa. Los autores señalan que estos tamaños variables son indicativos de la división proteolítica durante el proceso de fosforilación de la DSPP, aunque, no se puede descartar la posibilidad que diferentes ARN den origen a dos variantes en ratón.

Para la “inducción a la diferenciación condrogénica” de las células madre mesenquimales es esencial el cultivo a alta densidad celular. Este sistema de agregado o micromasa provee un medio ambiente tridimensional que permite las interacciones célula-célula, similar al observado en la condensación de precartílago durante el desarrollo embrionario81. Para la inducción a la diferenciación de las células de la pulpa dentaria, también se señala la necesidad de mediadores solubles específicos, particularmente el TGF-1, sin embargo, en el presente estudio se utilizó el medio nutritivo y agentes inductores como la dexametasona, la insulina, el ácido ascórbico 2 fosfato y el piruvato de sodio, con los que se logró la diferenciación hacia el linaje condrogénico.

Estudios previos han descrito la diferenciación de las células de la pulpa dentaria humana en adipocitos 5,8,10. En el presente estudio, la “inducción a la diferenciación adipogénica” se llevó a cabo utilizando agentes inductores adipogénicos, como el isobutil-metilxantina, la hidrocortisona, la indometacina y la insulina5,12. Aunque en la mayoría de los estudios utilizan la coloración histoquímica con Aceite Rojo O y la expresión de transcriptores específicos de los adipocitos (PPAR?2 y LPL) detectados por RT-PCR10,39,41,42,58 74. En el presente estudio se utilizó el Sudan III, que también es utilizado para colorear células que contienen lípidos y a través del cual se pudo evidenciar la diferenciación hacia el linaje adipogénico. La diferenciación hacia los linajes odontogénico-osteogénico, condrogénico y adipogénico de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana indica la presencia de células con características de células madre en las poblaciones de células aisladas. Resultados que son similares a los encontrados en otras investigaciones2,10,39,50,52,82 y es una de las propiedades de las células madre62. Las células madre mesenquimales fueron capaces de diferenciarse en células especializadas de otros tejidos de la misma capa embrionaria (condrocitos y adipocitos). Esta capacidad biológica se fundamenta en la capacidad que tienen las células madre de alterar su fenotipo en respuesta a los cambios del microambiente donde se desarrolla83,84.

En este estudio se identificaron células con características de células madre mesenquimales, como: la capacidad de adherirse a las placas de cultivo, la formación de colonias altamente proliferativas, una morfología fusiforme, la expresión consistente de marcadores de superficie que caracteriza a las células madre mesenquimales adultas de pulpa dentaria y la capacidad de diferenciarse hacia múltiples linajes. Pensamos que las células madre mesenquimales de pulpa dentaria humana identificadas en esta investigación cumplieron con los criterios mínimos85 para ser denominadas células madre mesenquimales.

Las células madre de la pulpa dentaria son una alternativa atractiva de origen de células madre mesenquimales por su relativo fácil aislamiento comparado con métodos más invasivos50. Lograr el aislamiento, cultivo y diferenciación, in vitro, de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana puede resultar de gran importancia en nuestra área, para promover la regeneración de los tejidos bucales, después de un daño o enfermedad. Especialmente, en la regeneración y la ingeniería del tejido óseo35 y el complejo dentino-pulpar86. Además, estas células podrían ser candidatas para ser utilizadas en la medicina regenerativa2,42; en la regeneración de tejido óseo, en la terapia de reemplazo en enfermedades neurodegenerativas,87 diabetes tipo 188,89 y en la terapia celular en enfermedades isquémicas90.


CONCLUSIONES
  1. Bajo las condiciones de aislamiento y cultivo llevadas a cabo en la presente investigación se establecieron células viables de la pulpa dentaria humana de terceros molares retenidos.

  2. Las células mesenquimales de la pulpa dentaria forman colonias adherentes, la mayoría presentan una morfología fusiforme semejante a fibroblastos, morfología que se mantiene durante los sucesivos pasajes, sin embargo, pueden mostrar cambios morfológicos sugerentes a una diferenciación espontánea.

  3. Se identificó la presencia de subpoblaciones de células madre mesenquimales de pulpa dentaria humana, de terceros molares, del tercer pasaje, a través de la expresión inmunocitoquímica de los marcadores de células madre mesenquimales, STRO-1+, CD-146+ y CD-45-.

  4. Se determinó la capacidad de diferenciación, in vitro, de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas, de terceros molares hacia los linajes odontogénico-osteogénico, condrogénico y adipogénico. Lo que demuestra la existencia de subpoblaciones de células con características de células madre en las poblaciones heterogéneas de células de la pulpa dentaria aisladas.


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
  1. Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Lalykina KS. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet 1970; 3: 393-403.

  2. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Gehron P, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(25):13625-13630.

  3. Morsczeck C, Schmalz G, Reichert TE, Vo?llner F, Galler K, Driemel O. Somatic stem cells for regenerative dentistry. Clin Oral Invest 2008: 12; 113- 118.

  4. Bello G, Merentes E, Arvelo F. Cultivo de queratinoscitos humanos in vitro. Gac Méd 1998; 106(4): 491-495.

  5. Huang AHC, Chen YK, Chan AWS, Shieb TY, Lin LM. Isolation and characterization of human dental pulp stem/stromal cells from nonextracted crown-fractured teeth requiring root canal therapy. J Endod 2009; 35(5): 673- 681.

  6. Zhang W, Walboomers XF, Wolke JGC, Bian Z, Fan MW, Jansen JA. Differentiation Ability of rat postnatal dental pulp cells in vitro. Tissue Eng 2005; 11(3/4): 357- 368.

  7. Mauth C, Huwig A, Graf-Hausner U, Roulet J-H. Restorative applications for dental pulp therapy. Topics in Tissue Engineering 2007; 3. Eds Ashammakhi N, Reis R, Chiellini E©.

  8. Wei X, Ling J, Wu L, Liu L, Xiao Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J Endod 2007; 33(6): 703- 708.

  9. Nakashima M. Establishment of primary cultures of pulp cells from bovine permanent incisors. Arch Oral Biol 1991; 36(9): 655- 663.

  10. Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher, Cherman N, Boyde A, DenBesten P, Gehron Robey P, Shi S. Stem cell properties of human dental pulp stem cell. J Dent Res 2002; 81(8):531-535.

  11. Kumabe S, Nakatsuka M, Kim G, Jue S, Aikawa F, Shin J, Iwai Y. Human dental pulp cell culture and cell transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anat. Jpn 2006; 82(4): 147-156.

  12. Sonoyama W, Yamaza T, Gronthos S, Shi S. Multipotent stem cells in dental pulp. En Freshney RI, Stacey GN, Auerbach JM editors. Culture of human stem cells. Wiley, New Jersey 2007:187-206.

  13. Mohd AB, Fazliah SN, Fadilah A, Asma H, Siti AR, Shaharum S, Jaafar S, Asiah AB, Shamsuria O. Stem cells from childrens´teeth. Archs Oral Sciences 2008: 3(1); 29- 31.

  14. Cheng PH, Snyder B, Fillos D, Ibegbu CC, Hung A, Chan A. Postnatal stem/progenitor cells derived from the dental pulp of adult chimpanzee. BMC Cell Biology 2008; 9(20):1-11.

  15. Gronthos s, Zannettino ACW, Hay SJ, Shi S, Graves SE, Kortesidis A, Simmons PJ. Molecular and cellular characterization of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J Cell Sci 2003; 116: 1827- 1835.

  16. D´Aquino R, Graciano A, Sampaolesi M, Laino G, Pirozzi G, De Rosa A, Papaccio G. Human postnatal dental pulp cells co-diferentiate into osteblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ 2007; 14: 1162-1171.

  17. Huang AHC, Chen YK, Chan AWS, Shieb TY, Lin LM, Shieh TY, Cha AWS. Isolation and characterization of dental pulp stem cells from a supernumerary tooth. J Oral Pathol Med 2008; 37: 571- 574.

  18. (30.) Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA, Rudakow. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro.colony assay method. Exp Hemat 1974; 2: 83- 92.

  19. Sonoyama W, Liu Y, Yamaza T, Tuan RS, Wang S, Shi S, Huang GTJ. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. J Endod 2008; 34(2): 166- 171.

  20. Magallanes M, Carmona B, Álvarez MA. Aislamiento y caracterización parcial de células madre de pulpa dental. Revista Odontológica Mexicana 2010; 14(1): 15- 20. www.medigraphic.org.mx

  21. Liu L, Ling J, Wei X, Wu L, Xiao Y. Stem cell regulatory gene expression in human adult dental pulp and periodontal ligament cells undergoing odontogenic/osteogenic differentiation. J Endod 2009; 35(10): 1368- 1376.

  22. Acosta AC. Cultivo de células del estroma de la médula ósea de rata y su potencial de diferenciación in vitro. Trabajo Especial de Grado 2003. Departamento de Zoología. Escuela de Biología. Facultad de Ciencias Universidad Central de Venezuela. Caracas.

  23. Mc Gee-Russell SM. Histochemical methods for calcium. J Histochem Cytochem 1958; 6: 22. Tomado de: Prophet EB, Mills B, Arrington JB, Sabin LH. Métodos Histotecnológicos. Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas de los Estados Unidos de America (AFIP); 1995. P 270.

  24. Nam S, Won JE, Kim CH, Kim HW. Odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells stimulated by the calcium phosphate porous granules. J Tissue Eng 2011. Article ID 812547, 10 pages. DOI: 10.4061/2011/812547. Fecha de consulta, Abril 2, 2011.

  25. Alliot-Licht B, Bluteau G, Magne D, Lopez-Cazaux S, Lieubeau B, Daculsi G, Guicheux J. Dexamethasone stimulates differentiation of odontoblast-like cells in human dental pulp cultures. Cell Tissue Res 2005; 321: 391- 400.

  26. Lopez-Cazaux S, Bluteau G, Magne D, Lieubeau B, Guicheux J, Alliot-Licht B. Culture medium modulates the behaviour of human dental pulp-derived cells: technical note. Eur Cell Mater 2006; 11: 35- 42.

  27. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr L, Randall RJ. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265- 275.

  28. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680- 685.

  29. Towbin H, Stachelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamida gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Procending Natural Science 1979; 76(9): 4350- 4354.

  30. Yu J, Deng Z, Shi J, Zhai H Nie X, Zhang H, Li Y, Jin Y. Differentiation of pulp stem cells into regular-shaped dentin-pulp complex induced by tooth germ cell conditioned medium. Tissue Eng 2006; 12(11):3097- 3105.

  31. 34.(331.) Márquez ML. Biología del verme de 21 días de S. mansoni: un estudio parasitológico, inmunológico y bioquímico. Tesis Doctoral Postgrado de Zoología Facultad de Ciencias Universidad Central de Venezuela. Caracas; 2004.

  32. Grottkau BE, Purudappa PP, Lin Y. Multilineage differentiation of dental pulp stem cells from green fluorescent protein transgenic mice. Int J Oral Sci 2010; 2(1): 21- 27. http://www.ijos.org.cn. doi: 10.4248/IJOS10015. Feha de consulta, Marzo 2010.

  33. Iohara K, Zheng L, Ito M, Tomokiyo A, Matsushita K, Nakashima M. Side population cells isolated from porcine dental pulp tissue with self-renewal and multipotency for dentinogenesis, chondrogenesis, adipogenesis, and neurogenesis. Stem Cells 2006; 24(11): 2493- 2503.

  34. Daddi L Nouvelle méthode pour colorer la graesse dansles tissues. Arch Ital Biol 1896; 26: 123-146. Tomado en Bancraft JD, Gamble M. Theory and practice of histological techniques. 7ma ed. 2008. Books.google,co.ve/books?isbn=0443102701. Fecha de consulta, Noviembre, 2010.

  35. D´Aquino R, De Rosa A, Lanza V, Tirino V, Laino L, Graziano A, Desiderio V, Laino G, Papaccio G. Human mandibule bone defect repair by the grafting of dental pulp stem/progenitor cells and collagen sponge biocomplexes. Eur Cell Master 2009; 18: 75- 83.

  36. Suchánek J, Soukup T, Ivaankova R, Karbanova J, Hubkova V, Pytlik R, Kucerova L. Human dental pulp Stem cells-isolation and long term cultivation. Acta Med (Hradec Kralove) 2007; 50(3): 195- 201.

  37. Perry BC, Zhou D, Wu X, Yang FC, Byers MA, Chu TMG,Hockema JJ, Woods E, Goebel WS. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Eng 2008; 14(2): 149- 156.

  38. Trino V, Pino F, De Rosa A, Papaccio G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol Biol 2012; 879: 443- 463.

  39. Baghaban MR, Nazarian H, Shariati M, Vahabi S. Human dental pulp stem cells: the culture optimization for increased growth. IJHOSCR 2009; 3(4): 5- 13.

  40. Nakamura S, Yamada Y, Katagiri W, Sugito T, Ito K, Ueda M. Stem cell proliferation pathways comparison between human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells by gene expression profile from promising dental pulp. J Endod 2009; 35(11): 1536- 1542. 41.

  41. Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Robey LW, Shi S. SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci USA 2003 May 13; 100(10): 5807- 5812.

  42. Baghaban MR, Vahabi S, Shariati M, Nazarian H. In vitro growth and characterization of stem cells from human dental pulp of deciduous versus permanent teeth. Journal of Dentristry, Tehran University of Medical Sciences 2010: 7(4); 185- 195.

  43. Laino G, d’ Aquino R, Graziano A, Lanza V, Carinci F, Naro F, Pirozzi G Papaccio G. A new population of human adult dental pulp stem cells: a useful source of living autologous fibrous bone tissue (LAB). J Bone Miner Res 2005; 20: 1454- 1402.

  44. Yokose S, Kadokura H, Tajima Y, Fujieda K, Katayama I, Matsuoka T, Katayama T. Establishment and characterization of a culture system for enzymatically released rat dental pulp cells. Calcif Tissue Int 2000; 66: 139-144.

  45. Kasugai S, Shibata S, Suzuki S, Ogura H. Characterization of a system of mineralized-tissue formation by rat dental pulp cells in culture. Arch Oral Biol 1993; 38(9): 769- 777.

  46. Fujiwara S, Kumabe S, Iwai Y. Isolated rat dental pulp cell culture and trasplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anat Jpn 2006; 83(1): 15- 24.

  47. Freshney RI. Culture of animal cells. A manual of basic tecnhique. 4ta ed. Editorial Wiley-Liss. Canada; 2000.

  48. Huang G TJ, Sonoyama W, Chen J, Park SH. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res 2006; 324: 225- 236.

  49. De Sousa ML, Bittar JD, Rodrigues IC,de Toledo OA,, Brigido MM, Poças-Fonseca MJ. Comparative isolation protocols and characterization of stem cells from human primary and permanent teeth pulp. Braz J Oral Sci 2010; 9(4):427- 433.

  50. Hilkens P, Gervois P, Fanton Y, Vanormelingen J, Martens, Struys W, Polites P, Lambricht I, Bronckkaers A. Effect of methodology on stem cell properties and multilinage differentiation potential of human dental pulp stem cell. Cell Tissue Res 2013; 353: 65- 78. Doi: 101007/s0041-013-1630-x.

  51. Batouli S, Miura M, Brahim J, Tsutsui TW, Fisher LW, Gronthos S, Robey PG, Shi S. Comparison of stem cell mediated osteogenesis and dentinogenesis. J Dent Res 2003; 82(12): 976- 981.

  52. Zhang W, Walboomers XF, van Kuppevelt TH, Daamen WF, Bian Z, Jansen JA. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials 2006; 27: 5658- 5668.

  53. Papaccio G, Graziano A, DÁquino R, Graziano MF, Pirozzi G, Menditti D, De Rosa A, Carinci F, Laino G. Long-term cryopreservation of dental pulp stem cells (SBP-DPSCs) and their differentiated osteoblasts: a cell source for tissue repair. J Cell Physiol 2006; 208: 319- 325.

  54. Bohl K, Shon J, Rutherford B, Mooney DJ. Role of synthetic extracellular matrix in development of engineered dental pulp. J Biomater Sci Polymer Edn 1998; 9(7): 749- 764.

  55. Kuo MYP, Lan WH, Lin SK, Tsal KS, Hahn LJ. Collagen gene expression in human dental pulp cell cultures. Archs Oral Biol 1992; 37(11): 945- 952.

  56. Baum BJ, Mooney DJ. The impact of tissue engineering on dentistry. J Am Dent Assoc 2000; 131: 309- 318.

  57. Pineda K, Merentes E, Starosta R. Caracterización morfológica y bioquímica de condrocitos in vitro. INHRR 2004; 35(1): 6-11.

  58. Govindasamy V, Ronald VS, Totey S, Din SB, Mustafa WM, Totey S, Zakaria Z Bhunde RR. Micromanipulation of culture niche permits long term expansion of dental pulp stem cells an economic and commercial angle. In Vitro Cell Dev Biol-Animal 2010. DOI: 10.1007/s11626-010-9332-0. Fecha de consulta, Abril 2, 2011.

  59. Shi S, Gronthos S. Perivascular niches of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J Dent Miner Res 2003; 18: 696- 704.

  60. Tsukamoto Y, Fukutani S, Shin-ike T, Kubota T, Sato S, Suzuki Y, Mori M. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Archs Oral Biol 1992,37(12): 1045- 1055.

  61. Yu J, He H, Tang C, Zhang G, Li Y, Wang R, Shi J, Jin Y. Differentiation potential of STRO-1 dental pulp stem cells changes during cell passaging. BMC Cell Biology 2010; 11: 32. http://www.biomedcentral.com/1471-2121/11/32.

  62. The stem cell. In Stem Cell Information (World Wide Web site). Bethesda, MD: National Institutes of Health, U.S. Department of Health and Human Services, 2006 Available at http://stemcells.nihgov/info/scireport/chaper1 (Fecha de consulta, Octubre 18, 2008)

  63. Simmons PJ, Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1. Blood 1991; 78(1): 55- 62.

  64. Gronthos S, Graves SE, Ohata S, Simmons PJ. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contain the osteogenic precursors. Blood 1994; 84(12):4164- 4173.

  65. Filshie RJ, Zannettino AC, Makrynikola V, Gronthos S, Henniker AJ, Bendall LJ, Gottlieb DJ, Simmons PJ, Bradstock, KF. MUC18, a member of the immunoglobulin superfamily, is expressed on bone marrow fibroblasts and a subset of hematological malignancies. Leukemia 1998; 12: 414- 421.

  66. Morsczeck C, Frerich B, Driemel O. Dental stem cell patents. Recent Patents on DNA & Gene Sequences 2009; 3: 39- 43.

  67. Yang X. Dental pulp stem cells for tissue engineering. Stro-1 selection and transfection strategies. Tesis Doctoral. Radboud University Nymegin, 2009. dare.ubn.Kunn.nl/bitstream/2066/74482/1174482.pdf

  68. Thesleff I, Sharpe P. Signalling networks regulating dental developmet. Mech of Dev 1997; 67: 111- 123.

  69. Thesleff I, Aberg T. Molecular regulation of tooth development. Bone 1999; 25(1): 123- 125.

  70. Smith AJ. Vitality of the dentin-pulp complex in health and disease: growth factors as key mediators. J Educ 2003; 67(6): 678- 689.

  71. Clarke NG. The morphology of the reparative dentine bridge. Oral Surg 1970; 29: 746- 752.

  72. Butler WT, Ritchie H. The nature and functional significance of dentin extracellular matrix proteins. Int J Dev Biol 1995; 39: 169- 179.

  73. Couble ML, Farges JC, Parra-Mabillon B, Boudeulle M, Magloire H. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explants cultures. Calcif Tissue Int 2000; 66:129-138.

  74. Jo YY, Lee HJ, KooK SY, Choung HW, Park JY, Chung JH, Choung YH, Kim ES, Yang HC, Choung PH. Isolation and characterization of postnatal stem cells from human dental tissues. Tissue Eng 2007; 13(4): 767- 773.

  75. Butler WT, Brunn JC, Qin C. Dentin extracellular matrix (ECM) proteins: comparison to bone ECM and contribution to dynamics of dentinogenesis. Connect Tissue Res 2003; 44: 171- 178.

  76. Feng JQ, Luans X, Wallace J, Jing D, Ohshima T, Kulkarni A B, D´Sousa RN, Kozak CA, MacDougall M. Genomic organization, chromosomal mapping, and promoter analysis of the mouse dentin sialophosphoprotein (Dspp)ngene, which codes for both dentin sialoprotein and dentin phosphoprotein. J Biol Chem 1998; 273(16): 9457- 9464.

  77. Goldberg M, Smith AJ. Cells and extracellular matrices of dentin and pulp: a biological basis for repair and tissue engineering. Crit Rev Oral Biol Med 2004; 15(1): 13- 27.

  78. Qin C, Brunn JC, Cadena E, Ridal A, Tsujigiwa H, Nagatsuka H, Nagai N, Butler WT. The expression of dentin sialophosphoprotein gene in bone. J Dent Res 2002; 81(6): 392- 394.

  79. Butler WT, Bhown M, Brunn J, D´Sousa RN, Farach-Carson MC, Happonen RP, Schrohenloher R, Seyer J, Somerman MJ, Foster R, Tomana M, Van Dijk S. Isolation, characterization and immunolocalization of a 53-kDa dentin sialoprotein (DSP). Matrix 1992; 12: 343- 351.

  80. Yalvaç ME, Ramazanoglu M, Tekguç M, Bayrak OF, Shafigullina AK, Salafutclinov II, Blatt NL, Kiyasov AP, Sahin F, Palotás A, Rizvanov AA. Human toth germ Stem cells preserve neuro-protective effects after long-term cryo-preservation. Current Neurovascular Research 2010; 7: 49- 58.

  81. Zhang L, Su P, Xu C, Yang J, Yu W, Huang D. Chondrogenic differentiation of humanan mesensechymal stem cells: a comparison between micromass and pellet culture systems. Biotechnol Lett 2010; 32: 1339- 1346.

  82. Karaöz E, Dogan BN, Aksoy A, Gacar G, Akyüz, Ayhan S, Genc ZS, Duruksu G, Demirca PC, Sariboyaci AE. Isolation and in vitro characterization of dental pulp stem cells from natal teeth. Histochem Cell Biol 2009. DOI 10.1007/soo418-008-0646-5. Fecha de consulta, Marzo 25 , 2011.

  83. Gokal P. What are stem cells? 2004: Dec;1-13. (Fecha de consulta, Octubre 18, 2008). http://www.csa.com/discoveryguides/stemcell/overview.php

  84. Frisén J. Stem cell plasticity? Neuron 2002; 35: 415- 418.

  85. Dominici M, Blanc K Le, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Krause DS, Deans RJ, Keating A, Prockop DJ, Horwitz EM. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8(4): 315- 317.

  86. Kaigler D, Mooney D. Tisue engineering´s impact on dentistry. J Dent Educ 2001; 65(5): 456- 462.

  87. Thie M, Degistirici Ö. Neural stem cells. 2006 PTC: WO 2006/100088 A1.

  88. Govindasamy V, Ronald VS, Abdullah AN, Ganesan Nathan KR, Ab Aziz, Abdullah ZAC, Musa S, Abu NH , Bhonde RR. Differentiation of dental pulp Stem cells into islet-like aggregates. J Dent Res 2011; 90(5): 646- 252.

  89. Kanafi MM, Rajeshwari YB, Gupta S, Dadheech N, Nair PD, Gupta PK, Bronde RR. Transplantation of islet-like cell clusters derived from human dental pulp stem cells restores normoglycemia in diabetic mice.

  90. Ishizaka R, Hayashi Y, Iohara K, Sugiyama M, Murakami M, Yamamoto T, Fukuta O, Nakashima. Stimulation of angiogénesis, neurogenesis and regeneration by side population cells from dental pulp. Biomaterials 2013; 34: 1888-1897.