Trabajos Originales

Establecimiento de cultivo, eficiencia de formación de colonias y proliferación celular de las células Mesenquimales de la pulpa dentaria humana

Recibido: 13/05/2013
Aceptado para Publicación: 19/06/2013

    Camejo Suárez, Ma. V., Profesor Asociado de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela, Miembro de la Sociedad Venezolana de Endodoncia. Merentes Díaz, E., Profesor Titular de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. Instituto de Biología Experimental, IBE. Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores

    CORRESPONDENCIA: valen_camejo@hotmail.com

    RECONOCIMIENTO: Queremos expresar nuestro agradecimiento al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH) de la Universidad Central de Venezuela por el apoyo financiero, a través del Proyecto Individual: PI-7507-2009, necesario ara ,letar a cabo esta investigación. También quiero agradecer al Lic. José Torres, asesor estadístico, profesor del Instituto de Investigaciones Odontológicas "Raúl Vincentelli" de la Facultad de Odontología por el cálculo estadístico de los datos.

ESTABLECIMIENTO DE CULTIVO, EFICIENCIA DE FORMACIÓN DE COLONIAS Y PROLIFERACIÓN CELULAR DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

RESUMEN
Las células madre han generado gran interés por su potencial en la medicina regenerativa. El objetivo de esta investigación fue establecer el cultivo de células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, identificar células madre mesenquimales en las poblaciones de células aisladas a través del análisis inmunocitoquímico y analizar la cinética de crecimiento de 7 líneas celulares. Las células mesenquimales de pulpa dentaria fueron aisladas de terceros molares retenidos de pacientes entre 15 y 19 años, con técnica de disgregación enzimática y cultivadas en medio DMEM-F12, suplementado con 15% de SFB, 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina y antibiótico-antimicótico. Las pruebas inmunocitoquímicas mostraron la existencia de células mesenquimales STRO-1+, CD146 + y CD45 - , lo que indica la presencia de células madre en las poblaciones aisladas. Las células aisladas además mostraron capacidad de autorrenovación y eficiencia de formación de colonias. El análisis de la proliferación celular mostró alta proliferación en algunas líneas celulares y diferencia estadísticamente significativas entre ellas. El conocimiento del comportamiento in vitro, de estas células es necesario para su futura utilización en la regenerativa de tejido.

PALABRAS CLAVE: Pulpa dentaria, Células madre mesenquimales, Proliferación celular



ESTABLISHMENT OF CULTURE, COLONY FORMING EFFICIENCY AND CELL PROLIFERATION OF MESENCHYMAL CELLS OF HUMAN DENTAL PULP

ABSTRACT
Stem cells have generated great interest for their potential in regenerative medicine. The objective of this study was to establish the mesenchymal cell culture of human dental pulp, identify mesenchymal stem cells in cell populations isolated by immunocytochemical analysis and analyze the kinetics of growth of cell lines 7 cells human dental pulp mesenchymal. The dental pulp mesenchymal cells were isolated from third molars of patients between 15 and 19 years, with enzymatic digestion technique and cultured in DMEM-F12, supplemented with 15% FBS, 100 mML-ascorbic acid 2-phosphate, 2mM L-glutamine, 100 / mL penicillin, 100ug/ ml streptomycin and 2 mg/ mL amphotericin B. Cells were observed daily under microscope. Tests showed inmunocytochemical cell populations in the presence of isolated mesenchymal cells STRO-1 +, CD146 + and CD45 -, which showed the presence of stem cell populations isolated. The isolated cells showed self-renewal capacity and efficiency of colony formation. The cell proliferation assay showed high proliferation in certain cell lines and statistically significant difference between them.

KEY WORDS: Dental pulp, Mesenchymal stem cells, Cell Proliferation


INTRODUCCIÓN

Las células madre son un grupo específico de células indiferenciadas que tienen un potencial proliferativo elevado y presentan dos características fundamentales: la capacidad de autorrenovación y la capacidad de generar uno o más tipos de células especializadas. Estas células han generado gran interés por su potencial en la medicina regenerativa. Las células madre mesenquimales son definidas como células multipotentes con el potencial para diferenciarse en osteoblastos, condroblastos y células adiposas y con la capacidad de autorrenovar su población por un tiempo relativamente largo. Estas células fueron aisladas inicialmente de medula ósea1, y posteriormente han sido encontradas poblaciones semejantes a células madre mesenquimales en múltiples tejidos, tales como: tejido adiposo, cordón umbilical, líquido amniótico, sangre periférica, hueso, cartílago, tejido muscular y tejido pulpar. Las células madre mesenquimales de pulpa dentaria fueron aisladas por primera vez por Gronthos y col.,2 en el 2000, de pulpa dentaria de terceros molares retenidos humanos y la mayor importancia de estas células es su capacidad de regenerar el complejo dentino-pulpar. Sin embargo, por su capacidad de diferenciarse hacia múltiples linaje, también podrían ser utilizadas en la regeneración de otros tejidos. El uso de células con propósitos regenerativos requiere de gran cantidad de células, las cuales deben ser preparadas antes de su trasplante, solas o en combinación con una matriz o soporte. Considerando la pequeña cantidad de tejido pulpar y por lo tanto su bajo contenido de células madre, la expansión de las células in vitro puede ser un inevitable paso en la preparación de las células para su uso en la ingeniería de tejidos y regeneración de tejido. De ahí la importancia de conocer la cinética de crecimiento de estas células 3. El objetivo de este trabajo de investigación fue establecer el cultivo de células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, identificar células madre mesenquimales en las poblaciones de células aisladas a través del análisis inmunocitoquímico y analizar la cinética de crecimiento de 7 líneas celulares de células mesenquimales de pulpa dentaria humana.


MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIAL BIOLÓGICO

SELECCIÓN DE PACIENTES Y EXTRACCIÓN DENTARIA

Se seleccionaron 8 pacientes jóvenes (donadores), sanos, de ambos sexos, entre 15 y 19 años de edad, que acudieron a la Clínica de Especialidades Odontológicas CEOMED y al Servicio de Cirugía Bucal del Postgrado de Cirugía de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela, a quienes se le extrajeron quirúrgicamente los terceros molares retenidos por razones de tratamiento (n= 14). El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela y los pacientes dieron su consentimiento. Una vez que los dientes fueron extraídos se colocaron inmediatamente en frascos estériles con medio de transporte para muestras humanas, constituido por medio F12 (GIBCO™) con doble dosis de antibióticos y antimicóticos (GIBCO®) para conservar las condiciones de asepsia y se mantuvieron a 4°C para conservar la viabilidad de las células y las condiciones fisiológicas4. Bajo estas condiciones fueron llevados al Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores del Instituto de Biología Experimental de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela, para el aislamiento de las células madre de la pulpa dentaria humana.

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE TEJIDO PULPAR

Después de la extracción de los órganos dentarios y una vez llevados al Laboratorio de Cultivo, se procedió a obtener el tejido pulpar bajo condiciones estériles. En la campana de flujo laminar horizontal, los dientes se lavaron 3 veces con solución buffer de fosfato (PBS: de las siglas en inglés phosphate buffered solution) frío; luego sobre una placa de Petri se limpió muy bien la superficie de los dientes, eliminando el tejido blando con una cureta y nuevamente los dientes se lavaron con PBS. Seguidamente, se realizó la desinfección de la superficie con una gasa estéril impregnada con solución desinfectante, etanol al 70 % 5-8 y luego se lavaron con PBS, frío. Seguidamente, a los dientes se les realizó un surco de 0,5 a 1 mm de profundidad 9 a 1 mm por debajo dg la tnaón cemento-esmalte2 usando un disco de carburo estéril a baja velocidad (Figura 1). Para mantener la viabilidad de las células durante el corte de los dientes, se conservaron a baja temperatura y condiciones de humedad constante. Se recomienda remojar los dientes en PBS frío, intermitentemente para evitar el calentamiento de los dientes, mientras se cortan10. Una vez realizado el surco, los dientes se colocaron en un frasco estéril con medio F12 frío. En los caso de dientes con solo un tercio radicular formado, el tejido pulpar fue retirado por la raíz con zondas barbadas y colocado de inmediato en medio fresco, DMEM (GIBCO™) - F12 frío. Bajo la campana de flujo laminar vertical, los dientes se fracturaron con un cincel a nivel de la ranura o surco realizado para exponer el tejido pulpar de la cámara5. El tejido pulpar se separó suavemente de la corona y la raíz2 y se extrajo con una cucharita de dentina o una cureta Gracey11 con ayuda de una pinza fina e inmediatamente se colocó el tejido en una pequeña cantidad de medio DMEM-F12 frío, sobre una placa de Petri, sin permitir que el tejido se secara. Posteriormente, se cortó en trozos pequeños con bisturí estéril10 o tijera quirúrgica fina12. Pulpas de 14 especímenes (terceros molares) de 8 pacientes fueron removidas y procesadas.

FIGURA 1
Terceros molares incompletamente formados recién extraídos.A) Después de la limpieza y desinfección de la superficie dentaria, realizada en la campana de flujo laminar horizontal; B) Confección del surco, 1 mm por debajo de la unión cemento-esmalte

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Para aislar las células, el tejido pulpar se colocó en una mezcla de solución enzimática de 4 mg/mL de colagenasa tipo I (SIGMA) { 2 mf/eL de dispasa (GIBCO™) en una proporción 1:1 por 60 minutos a 37 oC, no debe permanecer más de 1 hora porque es dañino para las células madre, usualmente toma de 30 a 60 minutos la disgregación del tejido pulpar10. La suspensión obtenida conteniendo las células aisladas se filtró a través de un filtro de células de 70 μm, para separar el tejido pulpar disgregado del no disgregado13. Posteriormente, la suspensión celular resultante se centrifugó durante 6 minutos a 500 g. Luego el taco celular obtenido, se resuspendió en el medio nutritivo para células mesenquimales, compuesto por: medio DMEM- F12 suplementado con 15% de SFB (GIBCO™), 100 μM L-ácido ascórbico 2-fosfato (Merck), 2 mM L-glutamina (Glutamax; GIBCO®), 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL de anfotericina B (GIBCO®) y fueron sembradas en placas de 4 pozos [(1,9 cm2 cada pozo) NUNC]. Las células aisladas de la pulpa dentaria, generalmente, son sembradas a una densidad de 0,1 a 1 x 103 células/cm2 10. En el presente trabajo se sembraron a una densidad que varió entre 0,1 a 1 x 104 células/cm2. La viabilidad celular se determinó con el colorante de exclusión Azul Tripano y se cuantificó el número de células con un hemocitómetro (Cámara Neubauer). Los cultivos fueron incubados a 37 oC, en atmósfera húmeda a un 95% de aire y un 5% de CO2. A las 24 a 48 horas se cambió el medio de cultivo, previo lavado con PBS, para así eliminar los restos de células y células no adherentes13.

CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Para analizar las características morfológicas y el comportamiento in vitro de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, se realizaron observaciones bajo el microscopio invertido de contrate de fases (Olympus I X50) acoplado a una computadora con programa TV Tuner y se tomaron los registros fotográficos correspondientes. El aspecto morfológico se determinó mediante coloración de rutina May-Grünwald-Giemsa14.

EXPRESIÓN DE MARCADORES ANTIGÉNICOS DE SUPERFICIE CELULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE!LA ULTA DENTARIA HUMANA A TRAVÉS DEL ANÁLISIS INMUNOCITOQUÍMICO

Para observar si en las poblaciones de células aisladas y cultivadas in vitro, están presentes células mesenquimales con un fenotipo indiferenciado, se utilizó la expresión de marcadores de superficie característicos de estas células, por métodos inmunocitoquímicos. Los anticuerpos anti-STRO-1 y anti-CD146 (MUC18), dos marcadores tempranos de células madre mesenquimales y el anti-CD45, un marcador específico para células hematopoyéticas, fueron utilizados. Las células de los subcultivos, del tercer pasahe, dd xulpa dentaria humana fueron sembradas a una densidad de 2 x 104 cel/cm2 en placas de 4 pozos y cultivadas durante la noche. Las células fueron lavadas 2 veces con PBS, pH 7,4. Las células se fijaron con metanol por 5 minutos. Una vez transcurrido este tiempo se lavaron 2 veces con PBS, seguidamente se agregó peróxido de hidrogeno a un 3% por 6 minutos, para inactivar la peroxidasa endógena. Luego se lavó 3 veces con PBS, se eliminó el exceso de líquido para posteriormente realizar la incubación con el anticuerpo primario monoclonal mouse anti-STRO-1 (1100;`Intitrogen™), el anticuerpo monoclonal anti-CD146 (1:100; eBioscience) y el anticuerpo monoclonal mouse anti-humano CD45 (1:100; Dako Denmark) por 35 minutos y se lavó con PBS y se dejó 5 minutos con PBS fresco, seguidamente se colocó el anticuerpo secundario biotinilado por 30 minutos, seguido del lavado con PBS, 2 veces y se dejó 5 minutos con PBS fresco. Posteriormente se incubó con solución ABC Vectastain® Elite por 30 minutos, seguido de 3 lavados con PBS fresco. Seguidamente, se preparó el sustrato para la peroxidasa, la Diaminobencidina (cromógeno) y se incubó por 5 a 10 minutos. Luego se lavó con agua destilada, varias veces. Por último, se contrastaron los núcleos con Hematoxilina por 1 a 2 minutos y se lavó suavemente con agua destilada. El Kit ABC usa un anticuerpo secundario biotinilado que se une al complejo estreptavidina- biotina- peroxidasa, el cual reacciona con el sustrato para peroxidasa (Diaminobencidina) produciendo un precipitado marrón que permitió evidenciar la unión antígeno-anticuerpo6.


DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE FORMACIÓN DE COLONIAS DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

La eficiencia de formación de colonias se determinó en 8 pacientes (8 líneas celulares). Se utilizaron células del tercer subcultivo, las células se sembraron a baja densidad [30 cel 8,8 cm2 (placa de 35mm) y a 100 cel 8,8 cm2 (placa de 35mm)], por triplicado, en medio DMEM - F12, suplementado con 15% SFB, 100 µM L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B. El medio nutritivo fue cambiado cada 4 dí!s. Alor 14 días, se realizó la evaluación de la eficiencia de la formación de colonias2,5,15. Los cultivos fueron fijados con metanol durante 5 minutos y se colorearon con Giemsa (diluido en una proporción 1: 15 con agua destilada). Grupos > 50 células se contaron como colonias2,16,17. Gronthos y col.16 en su estudio sobre la caracterización de alta pureza de las células madre mesenquimales de la médula ósea, los agregados > 50 células se contaron como unidades formadoras de colonias, mientras, que los agregados > 10 y < 50 células los contaron como racimos o grupos. De la misma manera fue considerado en la presente investigación. La eficiencia de formación de colonias se expresó en porcentaje, el número total de colonias se dividió entre el número inicial de células sembradas y el resultado se multiplicó por 100. Lo que indica el porcentaje de células capaces de formar colonias9,15,18, la capacidad para autorrenovarse y la capacidad de propagación a baja densidad15.

PROLIFERACIÓN CELULAR DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

La proliferación celular de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana se determinó en 7 líneas celulares (7 pacientes diferentes), debido a que la línea celular 2 no proliferó lo suficiente para realizar el ensayo. Para su determinación se utilizaron dos métodos: el contaje de las células en cámaras de Neubauer utilizando el colorante de exclusión Azul Tripano en 6 líneas celulares (líneas 1, 3, 4, 5, 7 y 8) y la prueba de proliferación del MTT 3-(4,5 Dimetiltiazol-2yl)-2,5 Bromuro de Difenil Tetrazolium] en 3 líneas celulares (líneas 3 , 6 y 7).

La proliferación celular se determinó a partir del tercer subcultivo y para el contaje de las células se sembraron a densidades celulares entre 8.000 y 16.000 células por pozo sobre placas de 24 pozos. Se realizaron cuatro contajes a los 1, 3, 5 y 7 días en total. La tasa de proliferación celular se calculó dividiendo el número total de células de cada día de cultivo entre el número inicial de células5. Este método fue utilizado en 6 líneas celulares.

El método del MTT, descrito por Mosmann19, se basa en la transformación de la sal de tetrazolium MTT de color amarillo y soluble en agua, a un compuesto insoluble morado llamado formazán, al producirse la ruptura del anillo tetrazolium por las enzimas deshidrogenasas de las mitocondrias activas; este método permite cuantificar el crecimiento celular determinando la densidad óptica. Este método fue utilizado en 3 líneas celulares. El método del MTT es una prueba colorimétrica cuantitativa de la proliferación y viabilidad celular. La prueba detecta las células vivas, no las células muertas y la señal generada es dependiente del grado de actividad celular. Este método puede ser utilizado para medir la proliferación y citotoxicidad. El resultado puede ser leído sobre una placa de multipozos con un espectrofotómetro (lector ELISA: de las siglas en inglés de Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Sus principales ventajas son su rapidez y precisión19.

Para determinar la proliferación celular con el método del MTT, las células de la pulpa dentaria se sembraron en placas multipozos (96 pozos) a una densidad de 3.000 cel/pozo y se dejaron por 1 a 7 días. Secuencialmente a 1, 3, 5 y 7 días se tomó una placa a la que se le retiró el medio de cultivo y se añadió el MTT disuelto en PBS a una concentración de 0,4 mg/mL y se dejó por 3 horas de incubación a 37 oC en atmósfera húmeda con un 5% de CO2, se descartó el MTT y posteriormente se agregó el Dimetil Sulfoxido (DMSO) para solubilizar los cristales de formazán formados, la lectura de las placas se realizó en un espectrofotómetro ELISA (Stat Fax-2100) a 540 nm8, conectado a una impresora Citizen GSX-190.

Con los datos obtenidos de la proliferación celular se trazaron las curvas de crecimiento celular de las diferentes líneas celulares establecidas, se comparó la proliferación entre las líneas celulares y se calculó el número de duplicación de la población, con la ecuación PDN= log N/No x 3,318 y el tiempo de duplicación de la población con la ecuación PDT=CT/log N/ No x 3,31. El cálculo del tiempo de duplicación de la población y número de duplicación de la población son métodos confiables para determinar la tasa de proliferación celular en condiciones de cultivo20.


EXPRESIÓN DE MARCADORES ANTIGÉNICOS DE SUPERFICIE CELULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA A TRAVÉS DEL ANÁLISIS INMUNOCITOQUÍMICO

Las células mesenquimales aisladas de la pulpa dentaria de terceros molares, del tercer subcultivo, expresaron moléculas de superficie celular STRO-1 (marcador de células madre mesenquimales) y CD146/MUC18 (marcador de células endoteliales) "positivas", considerados dos marcadores tempranos de células madre mesenquimales , mientras el marcador específico para células hematopoyéticas, el CD45 (antígeno común de leucocitos) fue "negativo". Las células "positivas" a las moléculas de superficie STRO-1 y CD146/MUC18 en las poblaciones de células aisladas, expresaron diferentes niveles de intensidad de expresión desde leve, moderada e intensa. Los marcadores no fueron uniformemente expresados, se encontraron en subgrupos de células, indicando que la población de células madre de pulpa dentaria es heterogénea. La morfología de las células que expresaron STRO-1 y CD146 "positivo" varió entre fusiforme, fusiformes con citoplasma ancho. La presencia de células marcadas con STRO-1+, CD146+ y CD45-, confirma la existencia de células madre o progenitoras en las poblaciones de células de la pulpa dentaria humana aisladas.

FIWURA :<"r> Establecimiento del cultivo de células mesenquimales de pulpa dentaria humana. Apariencia temprana de las células. A. Cultivo Primario. Cuatro días de cultivo, una colonia. 100x. B. Tercer subcultivo, cultivo confluente, población de células morfológicamente más homogéneas, células fusiformes, células en división (flecha). 200x. C. Sexto subcultivo: Gran confluencia celular. 100x. D. Formación de agregado celular (flecha). 40x. Contraste de fase

DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE FORMACIÓN DE COLONIAS DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

En los cultivos en monocapa de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas, las células fueron capaces de formar colonias a baja densidad. Las colonias estaban formadas por numerosas células adherentes, con morfología típica de fibroblastos, fusiformes, alargadas, con un citoplasma claro y un núcleo ovalado central con varios nucléolos, que identifica la CFU-F (Figura 3). Demostrando su capacidad de renovación y eficiencia de formación de colonias. Sin embargo, la eficiencia de formación de colonias expresada en porcentaje, varió entre las diferentes líneas celulares. Además, se observó una gran influencia entre el número de células sembradas y el número de colonias formadas. Las líneas celulares que se sembraron a muy baja densidad, 30 células por placa de 35 mm (8,8 cm2), fueron muy escasas o no formaron colonia ? 50, formaron agregados de 10 a 30 células. Mientras que las líneas celulares sembradas a una densidad de 100 células por placa de 35 mm (8,8 cm2) formaron un número mayor de colonias > 50 células, además de los agregados de 10 a 40 células, También hubo una línea celular que formó un monocapa a los 14 días (Tabla 1).

Tabla I
Eficiencia de formación de colonias de células mesenquimales de pulpa dentaria humana de 8 líneas celulares establecidas

FIGURA 3
Cultivo de células mesenquimales de pulpa dentaria humana a baja densidad, por 14 días, para la prueba de EFC. A. Placas de 35 mm (8,8 cm2), por triplicado. Se observan numerosas colonias coloreada con Giemsa (flecha) B. Formación de colonia con numerosas células fibroblásticas > 50. 25x. C Mayor detalle de las células, típicas de fibroblastos, fusiformes, un citoplasma claro con extensiones citoplasmáticas, un núcleo ovalado, central y varios nucléolos, 400x.

PROLIFERACIÓN CELULAR DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA AISLADAS

Se utilizaron dos métodos para el análisis de la proliferación de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, el contaje celular con cámara de Neubauer y el método del MTT, como se describió en materiales y métodos.

Las curvas de crecimiento celular obtenidas con el método del contaje celular, de las 6 líneas celulares evaluadas, mostraron algunas diferencias en su patrón de crecimiento. Las curvas de crecimiento de los cultivos mostraron que: a 1 día del cultivo, en la fase de latencia (lag), el número de las células de las líneas celulares 4, 5 y 8 disminuyó, esto es debido a que esta fase se considera una fase de adaptación a las condiciones del cultivo, sin embargo, las líneas celulares 1, 3 y 7 mostraron un aumento en el número de células. En la fase de crecimiento exponencial (log) de rápido crecimiento, las líneas 1 y 5 mostraron un patrón parecido desde el día 3 al 5 en el que las células aumentaron su número logrando un pico en el día 5 que bajó rápidamente en el día 7, entrando en una fase de senescencia y muerte . Mientras, las líneas celulares 3, 4, 7 y 8 mostraron un patrón de crecimiento continuo, que fue muy marcado entre el día 5 y 7, excepto en el caso de la línea celular 4 que no mostró un marcado crecimiento (Gráfico 1 y 2). En la Tabla 2 y el Gráfico 3 se muestra la tasa de proliferación celular de las 6 líneas celulares evaluadas con este método.

GRÁFICO 1
Curvas de proliferación celular de las líneas 1, 3, 4, 5 de células mesenquimales de la pulpa dentaria humana. Método de contaje celular con cámara de Neubauer

GRÁFICO 2
Curvas de proliferación celular de las líneas celulares 7 y 8 de células mesenquimales de la pulpa dentaria humana. Método de contaje celular con cámara de Neubauer

Tabla II
Tasa de proliferación celular de 6 líneas celulares, de células mesenquimales de pulpa dentaria humana. Método de contaje celular con cámara de Neubauer

GRÁFICO 3
Tasa de proliferación celular de 6 líneas celulares de células mesenquimales de pulpa dentaria humana. Método de contaje celular con cámara de Neubauer

Una vez determinada la proliferación celular por el método de contaje celular es de interés probar si existen diferencias entre las líneas celulares en los diferentes días de cultivo. Se empleó para los diferentes contrastes de hipótesis la prueba no paramétrica de U de Mann-Whitney. Los resultados obtenidos muestran que en todas las combinaciones "Contrastes de Hipótesis" se confirmó que en por lo menos uno de los períodos "Días de Cultivo" se evidencia desde el punto de vista estadístico diferencias significativas en la proliferación celular entre las líneas comparadas (p < 0,05), salvo en tres de los casos de las comparaciones (líneas Uno vs. Cuatro; Uno vs. Ocho y Cuatro vs. Ocho) que en ninguno de los periodos "Días de Cultivo" se evidencio diferencia significativas en los valores de la proliferación celular.

Las curvas de proliferación celular obtenidas con el método del MTT de las líneas celulares 3, 6 y 7 muestran, en la fase de latencia (lag) del día 1 al 3 del cultivo, el número de células disminuyó, seguido de la fase exponencial (log) del día 3 al día 7 del cultivo en el que las células aumentaron su número, lo que fue rápido y marcado del día 5 al 7 en las líneas celulares 6 y 7. Mientras, que el crecimiento de la línea celular 3 fue progresivo pero menos marcado que en las líneas 6 y 7 (Gráficos 4).

GRÁFICO 4
Curvas de proliferación celular, de 3 líneas celulares, de células mesenquimales de pulpa dentaria humana. Método del MTT

Los datos estadísticos obtenidos para evaluar la proliferación de 3 líneas celulares (Media, Mediana y Desviación típica), por día de cultivo, con el método del MTT, no muestran variaciones significativas salvo en el día 5 de la línea 7 y en el día 7 de las 3 líneas celulares, donde estos estadísticos muestran variaciones absolutas significativas, lo que se va a corroborar mediante el uso de test estadístico según el caso. Se empleó la prueba estadística no paramétrica Kruskal-Wallis y se determinó que existen diferencias significativas entre los niveles de la proliferación celular por el método MTT, en la línea celular 3, entre los diferentes días de cultivo. Para las líneas 6 y 7 también fueron diferentes. Además, se determinó la existencia de diferencias entre los niveles de proliferación celular, pero entre las líneas celulares estudiadas por día de cultivo.

El cálculo y análisis del número y tiempo de duplicación de la población de las células mesenquimales de pulpa dentaria humana aisladas, del tercer y cuarto subcultivo, se realizó en el primero, tercero, quinto y séptimo día de cultivo, lo que demostró que hubo líneas que duplicaron su población entre 1 y 4,6 veces, mientras que en otras, no hubo duplicación de la población. El tiempo de duplicación de la población también varió entre 1 día a 5,07 días. Es de destacar que en la línea celular 7, a los 3 días de cultivo se observó un número de duplicación de la población de 3,03 veces en 1,4 días, a los 7 días del cultivo, el número de duplicación de la población fue de 4, 6 veces y para su duplicación requirió de 0,9 días mostrando una muy rápida y alta proliferación celular. En la línea 8, a los 7 días de cultivo el número de duplicación de la población fue de 3,15 veces y para la duplicación requirió de 2,2 días, demostrando también una rápida y alta proliferación celular (Tabla 3).

Tabla III
Número y tiempo de duplicación de la población de 6 líneas celulares de células mesenquimales de pulpa dentaria humana, según los días 1,3,5 y 7 de cultivo

DISCUSIÓN

El objetivo de este trabajo de investigación fue establecer el cultivo de células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, identificar células madre mesenquimales en las poblaciones de células aisladas a través del análisis inmunocitoquímico y analizar la cinética de crecimiento de 7 líneas celulares de células mesenquimales de pulpa dentaria humana.

Para el aislamiento de las células mesenquimales de la pulpa dentaria, la mayoría de los investigadores 2,3,6,8-10,13,15,17,21-23 utilizan el método de disgregación enzimática, descrito por Gronthos y col.2 Igualmente, en el presente estudio se seleccionó este método, porque se consigue un gran número de células aisladas en corto tiempo y más representativo del tejido, que con las técnicas por explantes24,25. Las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas, de terceros molares, mostraron un óptimo crecimiento, cultivadas en medio DMEM-F12, suplementado con 15% de SFB, 100 µM L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina y 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B (antibiótico-antimicótico), condiciones de cultivo descritas previamente como óptimas. Las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas, mostraron la morfológica típica de fibroblastos, células fusiformes con finas extensiones citoplasmáticas, lo que coincide con numerosas investigaciones 2,6,7,22,24 y es análoga a la progenie de la médula ósea humana.2 Morfología que se mantuvo durante los sucesivos pasajes. Sin embargo, en 3 de 4 líneas celulares que se sometieron a más de 6 subcultivos, además de la gran proliferación celular se observó la presencia de algunos agregados celulares en el sexto, séptimo y octavo subcultivo. Las células cercanas al agregado mostraron algunos cambios morfológicos sugerentes a una posible diferenciación espontánea. Mientras, que en el resto del cultivo las células conservaban su morfología fusiforme semejante a fibroblastos.

La diferenciación espontánea de las células madre de pulpa dentaria sin añadir un medio inductor fue descrita por Alliot-Licht y col.,25 los autores refieren que la transformación espontanea del fenotipo celular puede ocurrir durante el cultivo. El proceso de mineralización ocurrió en ausencia de dexametasona y B-GP. Los nódulos mineralizados fueron observados en cultivos primarios con largo tiempo de cultivo y en subcultivos del quinto pasaje. También, Tsukamoto y col.26 observaron que las células de la pulpa de dientes temporales humanos, formaron nódulos mineralizados cuando crecieron en medio de cultivo en ausencia de medios inductores. La matriz formada en estos nódulos se tiñó fuertemente con von Kossa. Alrededor y entre estos nódulos las células fibroblásticas formaron una monocapa regular. Los autores observaron que la formación de nódulos mineralizados depende de la capacidad de las células para formar multicapas, in vitro. La ausencia del contacto inhibitorio parece esencial para proveer la estructura tridimensional que es necesaria para obtener un tejido mineralizado.

Para el análisis de la expresión de antígenos de superficie de las células mesenquimales de pulpa dentaria humana, a través de técnicas inmunocitoquímicas, para demostrar la presencia de células madre mesenquimales en la población de células aislada, se seleccionaron los anticuerpos anti- STRO-1, anti-CD146 y anti-CD45. Los resultados mostraron que las células aisladas de pulpa dentaria, del tercer pasaje expresaron moléculas de superficie celular STRO-1 y CD146 "positivos", dos marcadores tempranos de células madre mesenquimales, también presentes en estudios previos en células madre mesnqui-algs de medula ósea y en células madre de pulpa dentaria humana de dientes permanentes2,8,27 y en dientes temporales exfoliados22 mientras, el marcador específico para células hematopoyéticas, el CD45, que reconoce el antígeno común de leucocito, monocitos y subgrupos de células T, fue "negativo". La ausencia de expresión de este marcador, indica que en las células aisladas de la pulpa, no están presentes progenitoras hematopoyéticas23 y coincide con los resultados de otras investigaciones2,5,8,23.

En particular, el STRO-1 es extremadamente importante en la selección de las células madre de la pulpa dentaria, solo las células STRO-1+ son capaces de diferenciarse en células semejantes a odontoblastos, lo que indica la importación de estas células en el proceso de reparación28 . Las células madre contenidas en los cultivos de células de la pulpa dentaria expresan CD146, marcador de células de músculo liso, células endoteliales y pericitos, lo que indica que estas células pueden ser originadas de un microambiente perivascular22 . Los autores29 observaron que ambos anticuerpos el anti-STRO-1 y el anti-CD146 marcaban las mismas poblaciones celulares precursoras.

En la determinación de la eficiencia de formación de colonias de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana se observó que al sembrar 30 células por placa, la formación de colonias fue escasa o no se produjo, mientras que al sembrar 100 células por placa se formaron un mayor número de colonias. Se evidenció una estrecha relación entre el número de células cultivadas y el número de colonias fibroblásticas que se desarrollaron, esto coincide con las observaciones realizadas por Friedenteins18, en el cultivo de células mesenquimales de medula ósea. La formación de colonias ocurre solo cuando la siembra se desarrolla a una cierta densidad inicial óptima de células, en caso de excesivo número de células por unidad de superficie los fibroblastos forman una monocapa, mientras en caso de insuficiente densidad ellas fallan en crecer. Establecer la EFC-F resulta en una correlación lineal entre el número de colonias y el número de células sembradas30.

Se observó también, que las células mesenquimales de la pulpa dentaria aisladas, de algunas líneas celulares, mostraron un gran potencial de autorrenovación, pero éste fue variable lo que coincide con las observaciones realizadas en células mesenquimales de medula ósea y se puede explicar, por que hay subpoblaciones en diferentes estados de diferenciación 31.

Gronthos y col.2 observaron que las células madre aisladas de pulpa dentaria de terceros molares exhiben una alta tasa de proliferación, comparada con las células madre mesenquimales de medula ósea, in vitro. Esto puede ser atribuido al estado de desarrollo del tejido respectivo, los terceros molares son los últimos dientes permanentes en completar su desarrollo y hacer erupción y están en un temprano estado de desarrollo comparado con la médula ósea adulta. En el presente estudio se observó que las células de la pulpa dentaria de terceros molares, cultivadas bajo específicas condiciones son altamente proliferativas, sin embargo mostraron diferencias en la proliferación celular entre las distintas líneas de células mesenquimales de la pulpa dentaria evaluadas. También, se pudo observar que con los dos métodos (el contaje celular con cámara de Neubauer y el MTT) utilizados para determinar la proliferación celular hubo un comportamiento similar en el patrón de crecimiento, aunque se sabe que el método MTT, es más preciso19.

Al tratar de analizar la cinética de crecimiento de las diferentes líneas celulares relacionando la EFC y los valores de la proliferación celular, se pudo observar que las líneas que mostraron mayores porcentajes de CFU-F, también presentaban los mayores valores de proliferación celular, entre ellas las líneas 6, 7 y 8. Igualmente se evidencia como coinciden los datosobte~ios al calcular el número de duplicación de la población con las curvas de crecimiento trazadas, se evidencia también que la línea celulares 7 (se duplicó 4,65 veces) y la línea celular 8 (se duplicó 3,15 veces), fueron las líneas celulares que mostraron los mayores valores de proligerai÷n. Para la línea celular 6 no se pudo calcular el número y tiempo de duplicación porque no se hizo el contaje celular con la cámara de Nuebauer sino solo con el método del MTT, y no se tenían los valores para realizar los cálculos, sin embargo en la gráfica de la curva de crecimiento se evidenCia u~ omportamiento similar a las líneas 7 y 8.

En cuanto al tiempo en que se duplicó la población de células mesenquimales de pulpa dentaria aisladas, los resultados en la presente investigación mostraron que fue de 1,4 días a 5,07 días y el valor del número de duplicación de la población fue de 1 a 4,6 veces en células del tercer y cuarto pasaje en los días 5 y 7 del cultivo. Nakashima12 describe un crecimiento rápido entre el 5,5 y 9 día, el tiempo de duplicación de la población fue de 1 día. Baghaban y col.3 describe un número de duplicación de la población de 10,96 veces a los 10 días de cultivo. Baghaban y col.20 señalan que las células madre aisladas de terceros molares tendían a duplicar su población en un promedio de 20,79 ± 2,8 horas (casi un día). Govindasamy y col.32 con la utilización del medio DMEM-F12 obtuvieron un promedio de tiempo de duplicación de la población de 30,6 ± 2,25 horas. Por lo que los valores obtenidos en la presente investigación están dentro de los descritos en otras investigaciones.

Para la reconstrucción de tejidos se necesitan grandes cantidades de células para su trasplante en el lugar de la lesión. La obtención de líneas celulares altamente proliferativas permitiría su utilización en investigaciones en la medicina regeneración. Bagheban y col.3 realizan un estudio para determinar las condiciones optimas de cultivo para una mejor proliferación de las células madre de pulpa dentaria humana, consideradas como candidatas promisorias para la regeneración dentaria así como también la reparación de tejido óseo. Estos autores demostraron una adecuada proliferación con la utilización de 15% y 20% pero fue mayor con 20% de SFB y la densidad inicial de células sembradas, obtuvieron un máximo incremento en el número de células cuando las células se sembraban a baja densidad 100 cel/cm2. En el presente estudio se utilizo 15% SFB y se sembraron a una densidad que vario entre 0,1 a 1 X 104 . Se requiere de más investigaciones para conocer mejor el comportamiento in vitro de estas células, para su posible utilización en el futuro.


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
  1. Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Lalykina KS. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet 1970; 3: 393-403

  2. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Gehron P, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(25):13625-13630

  3. Baghaban MR, Nazarian H, Shariati M, Vahabi S. Human dental pulp stem cells: the culture optimization for increased growth. IJHOSCR 2009; 3(4): 5- 13

  4. Bello G, Merentes E, Arvelo F. Cultivo de queratinocitos humanos in vitro. Gac Méd 1998; 106(4): 491-495

  5. Huang AHC, Chen YK, Chan AWS, Shieb TY, Lin LM. Isolation and characterization of human dental pulp stem/stromal cells from nonextracted crown-fractured teeth requiring root canal therapy. J Endod 2009; 35(5): 673- 681

  6. Zhang W, Walboomers XF, Wolke JGC, Bian Z, Fan MW, Jansen JA. Differentiation ability of rat postnatal dental pulp cells in vitro. Tissue Eng 2005; 11(3/4): 357- 368

  7. Mauth C, Huwig A, Graf-Hausner U, Roulet J-H. Restorative applications for dental pulp therapy. Topics in Tissue Engineering 2007; 3. Eds Ashammakhi N, Reis R, Chiellini E©

  8. Wei X, Ling J, Wu L, Liu L, Xiao Y. Expression of mineralization markurs if $ental pulp cells. J Endod 2007; 33(6): 703- 708

  9. Huang AHC, Chen YK, Chan AWS, Shieb TY, Lin LM, Shieh TY, Cha AWS. Isolation and characterization of dental pulp stem cells from a supernumerary tooth. J Oral Pathol Med 2008; 37: 571- 574. 149

  10. Sonoyama W, Yamaza T, Gronthos S, Shi S. Multipotent stem cells in dental pulp. En Freshney RI, Stacey GN, Auerbach JM editors. Culture of human stem cells. Wiley, New Jersey 2007:187-206

  11. Alliot-Licht B, Bluteau G, Magne D, Lopez-Cazaux S, Lieubeau B, Daculsi G, Guicheux J. Dexamethasone stimulates differentiation of odontoblast-like cells in human dental pulp cultures. Cell Tissue Res 2005; 321: 391- 400

  12. Nakashima M. Establishment of primary cultures of pulp cells from bovine permanent incisors. Arch Oral Biol 1991; 36(9): 655- 663

  13. Mohd AB, Fazliah SN, Fadilah A, Asma H, Siti AR, Shaharum S, Jaafar S, Asiah AB, Shamsuria O. Stem cells from childrens´teeth. Archs Oral Sciences 2008: 3(1); 29- 31

  14. Urbaneja M, Gugig M, Bello R. Cultivo de tejidos animales. Trabajo de laboratorio. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias. Escuela de Biología. Caracas, 1975

  15. Cheng PH, Snyder B, Fillos D, Ibegbu CC, Hung A, Chan A. Postnatal stem/progenitor cells derived from the dental pulp of adult chimpanzee. BMC Cell Biology 2008; 9(20):1-11

  16. Gronthos s, Zannettino ACW, Hay SJ, Shi S, Graves SE, Kortesidis A, Simmons PJ. Molecular and cellular characterization of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J Cell Sci 2003; 116: 1827- 1835

  17. D´Aquino R, Graciano A, Sampaolesi M, Laino G, Pirozzi G, De Rosa A, Papaccio G. Human postnatal dental pulp cells co-diferentiate into osteblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ 2007; 14: 1162-1171

  18. Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA, Rudakow. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro.colony assay method. Exp Hemat 1974; 2: 83- 92

  19. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65 (1-2): 55-63

  20. Baghaban MR, Vahabi S, Shariati M, Nazarian H. In vitro growth and characterization of stem cells from human dental pulp of deciduous versus permanent teeth. Journal of Dentristry, Tehran University of Medical Sciences 2010: 7(4); 185- 195

  21. Sonoyama W, Liu Y, Yamaza T, Tuan RS, Wang S, Shi S, Huang GTJ. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. J Endod 2008; 34(2): 166- 171

  22. Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Robey LW, Shi S. SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci USA 2003 May 13; 100(10): 5807-5812

  23. Laino G, d' Aquino R, Graziano A, Lanza V, Carinci F, Naro F, Pirozzi G Papaccio G. A new population of human adult dental pulp stem cells: a useful source of living autologous fibrous bone tissue (LAB). J Bone Miner Res 2005; 20: 1454-1402

  24. Takeyasu M, Nozaki T, Watanabe M, Shinohara M, Morita J, Hidaka A, Iwamoto K, Takahashi T, Nagata S, Daito M, Ohura K. In vitro osteogenic differentiation potential of dental pulp stem cells. J Oral Tissue Eng 2004;2(1): 25-30

  25. Alliot-Licht B, Hurtrel D, Gregoire M. Characterization of ?-smooth mucle actin positive cells in mineralized human dental pulp cultures. Archs Oral Biol 2001; 46: 221-228

  26. Tsukamoto Y, Fukutani S, Shin-ike T, Kubota T, Sato S, Suzuki Y, Mori M. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Archs Oral Biol 1992; 37(12): 1045-1055

  27. Nam S, Won JE, Kim CH, Kim HW. Odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells stimulated by the calcium phosphate porous granules. Journal of Tissue Engineering 2011. Article ID 812547,10 pages. DOI: 10.4061/2011/812547. Fecha de consulta 2 de Abril 2011

  28. Yang X. Dental pulp stem cells for tissue engineering. Stro-1 selection and transfection strategies. Tesis Doctoral. Radboud University Nymegin, 2009. dare.ubn.Kunn.nl/bitstream/2066/74482/1174482.pdf

  29. Filshie RJ, Zannettino AC, Makrynikola V, Gronthos S, Henniker AJ, Bendall LJ, Gottlieb DJ, Simmons PJ, Bradstock, KF. MUC18, a member of the immunoglobulin superfamily, is expressed on bone marrow fibroblasts and a subset of hematological malignancies. Leukemia 1998; 12: 414- 421

  30. Friedenstein AJ. Stromal mechanisms of bone marrow: cloning in vitro and retransplantation in vivo. Haematol Blood Transfus 1980; 25: 19- 29

  31. Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med 2004; 8(3): 301-316

  32. Govindasamy V, Ronald VS, Totey S, Din SB, Mustafa WM, Totey S, Zakaria Z Bhunde RR. Micromanipulation of culture niche permits long term expansion of dental pulp stem cells an economic and commercial angle. In Vitro Cell Dev Biol-Animal 2010. DOI: 10.1007/s11626-010-9332-0. Fecha de consulta: 2 de Abril 2011