Trabajos Originales

Aislamiento y caracterización de las Células Madre Mesenquimales de la pulpa dentaria humana

Recibido para Arbitraje: 28/01/2013
Aceptado para Publicación: 04/06/2013

    Camejo Suárez, Ma. V., Profesor Asociado de la Facultad de Odontología de La Universidad Central de Venezuela. Miembro de la Sociedad Venezolana de Endodoncia. Merentes Díaz, E., Profesor Titular de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. Instituto de Biología Experimental, IBE. Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores. Márquez, Ma. L., Profesor Asistente de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. Instituto de Biología Experimental, IBE. Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores. González Blanco, O., Profesor Titular Jubilado de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela.

    CORRESPONDENCIA: María Valentina Camejo Suárez. Cátedra de Endodoncia. Facultad de Odontología. UCV. TLF. 605 3834. valen_camejo@hotmail.com

    RECONOCIMIENTO: Quiero expresar mi agradecimiento al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH) de la Universidad Central de Venezuela por el apoyo financiero, a través del Proyecto Individual: PI-7507-2009, necesario para llevar a cabo esta investigación.

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

RESUMEN
Las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria han surgido como una herramienta promisoria en la medicina regenerativa. El objetivo de la presente investigación es establecer el cultivo de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana. Estas fueron aisladas de terceros molares retenidos de pacientes entre 15 y 24 años, con técnica de disgregación enzimática y cultivadas en medio DMEM-F12, suplementado con 15% de SFB , 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL de anfotericina B . Las células fueron observadas diariamente bajo microscopio. Pruebas inmunohistoquímicas mostraron en las poblaciones de células aisladas la existencia de células mesenquimales STRO-1+, marcador de células madre mesenquimales, también expresaron CD146+ y no expresaron CD45-, marcador de células hematopoyéticas. Las células aisladas mostraron capacidad de autorrenovación y eficiencia de formación de colonias. En el presente estudio, en las poblaciones de células aisladas se identificaron células con características de células madre mesenquimales, como su capacidad de adherirse a las placas plásticas en cultivo, formar colonias altamente proliferativas, su morfología fusiforme y la expresión consistente de marcadores de superficie que caracteriza células madre mesenquimales adultas de pulpa dentaria. Sin embargo, faltaría determinar su capacidad de diferenciación para cumplir con los criterios básicos para definirlas como células madre.

PALABRAS CLAVE: Pulpa dentaria, células madre mesenquimales, aislamiento, cultivo.



ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF STEM CELLS MESENCHYMAL OF HUMAN DENTAL PULP

ABSTRACT
Mesenchymal stem cells dental pulp-derived have emerged as a promising tool in regenerative medicine. The objective of the present investigation is to establish the culture of mesenchymal stem cells of dental pulp human. The dental pulp mesenchymal cells were isolated from impacted third molars of patients between 15-24 year-old. The dental pulp tissue was extracted, enzymatic digestion technique and culture in medium DMEM-F12, supplemented with 15% de SFB , 100 ?M L-ascorbic acid 2- phosphate, 2 mM L-glutamine, 100 U/mL de penicillin, 100 µg/mL de streptomycin y 2 µg/mL de amphotericin B. Cells were observed daily under microscope. Immunocytochemistry tests showed cells STRO-1+ mesenchymal stem cell marker. These cells also expressed CD146+ and no expressed CD45- hematopoietic stem cell marker. The isolated cells showed self-renewal capabilities and colony-forming efficiency. In this study, isolated cell populations were identified cells with mesenchymal stem cell characteristics, such as its ability to adhere to plastic culture plates, highly proliferative colony forming, fusiform morphology and consistent expression of surface markers characterized adult mesenchymal stem cells from dental pulp. However, missing differentiating their ability to meet the basic criteria to define them as stem cells.

KEY WORDS: Dental pulp, mesenchymal stem cells, isolation, cultivation.


INTRODUCCIÓN

Las células madre adultas ofrecen una esperanza para el futuro tanto en medicina como en odontología. Estas células tienen un gran potencial para ser utilizadas en la terapia celular y la ingeniería de tejidos, por su capacidad de regenerar órganos dañados y enfermos. Las células madre son poblaciones de células indiferenciadas, que se definen como células clonogénicas, que tienen dos propiedades: a) la autorrenovación, que es la capacidad de dividirse en más células madre y b) la capacidad de diferenciarse en uno o varios tipos de células especializadas, bajo condiciones apropiadas o señales correctas del micromedio ambiente1-5. Las células madre se pueden clasificar de acuerdo a su potencialidad, en: totipotentes, pluripotentes, multipotentes y unipotentes4-6. También, se pueden clasificar de acuerdo al tejido de donde se pueden obtener, es decir de acuerdo a su origen, en células madre embrionarias procedentes del embrión y células madre adultas o postnatales procedente de adultos y niños 5,7.

Las células madre adultas han recibido gran atención, debido al descubrimiento de su capacidad para formar múltiples tipos de células y tejidos, así como también, el hallazgo de estas células en un número creciente de tejidos 8. La principal función de las células madre adultas es mantener y reparar el tejido de origen, es decir, en el cual ellas residen 9. Ellas tienen la capacidad de renovar las células después de un trauma, una enfermedad o por la edad 10. En un principio, se pensó que estas células estaban predeterminadas a diferenciarse a un tipo celular procedente de su mismo tejido de origen o de su misma capa embrionaria, sin embargo, se considera la posibilidad que las células madre de tejidos adultos puedan generar tipos de células especializadas de otros tipos de tejido desde el cual ellas normalmente residen y son capaces de diferenciarse funcionalmente a células especializadas procedentes de la misma capa embrionaria o de capas embrionarias distintas a las de su origen. Esta capacidad se conoce como "fenómeno de plasticidad" 3,4,6,9,11,12. Actualmente, la lista de tejidos adultos descritos que contienen células madre adultas está creciendo e incluye, las células madre de la médula ósea, las células madre del líquido amniótico, el cordón umbilical, la sangre del cordón umbilical, las células madre de la sangre periférica, cerebro, la pulpa dentaria, vasos sanguíneos, músculo esquelético, tejido epitelial de la piel y del sistema digestivo, cornea, la retina, el hígado y el páncreas, entre otros 9,13. En el tejido dentario se han identificado y caracterizado poblaciones de células madre adultas derivadas de la pulpa dentaria, el ligamento periodontal, la papila apical y el folículo dentario. Las células madre de la pulpa dentaria fueron aisladas por primera vez por Gronthos y col.14, en el 2000, de pulpa de terceros molares retenidos. Los datos presentados en su investigación demuestran que la pulpa dentaria adulta contiene células que son clonogénicas, altamente proliferativas y capaces de regenerar tejido mineralizado, propiedades que las define como células madre. Son células multipotentes, capaces de diferenciarse en varios tipos de células 14,15. Las células madre mesenquimales de pulpa dentaria exhiben características similares a las células madre mesenquimales de médula ósea16. por lo que podrían ser consideradas como una alternativa más fácilmente accesible de células madre adultas.

El objetivo general del presente trabajo de investigación es establecer el cultivo de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana.


MATERIALES Y MÉTODOS

1. MATERIAL BIOLÓGICO

1.1. SELECCIÓN DE PACIENTES Y EXTRACCIÓN DENTARIA

Se seleccionaron pacientes jóvenes entre 15 y 24 años de edad, sanos, de ambos sexos, que acudieron a la Clínica de Especialidades Odontológicas CEOMED y al Servicio de Cirugía Bucal del Postgrado de Cirugía de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela, a quienes se les extrajeron quirúrgicamente los terceros molares retenidos por razones de tratamiento. Los pacientes dieron su consentimiento y el protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela. Una vez que los dientes fueron extraídos se colocaron inmediatamente en frascos estériles con medio de transporte para muestras humanas, constituido por medio F12 (GIBCO™) con doble dosis de antibióticos y antimicóticos (GIBCO®) para conservar las condiciones de asepsia y se mantuvieron a 4°C para conservar la viabilidad de las células y las condiciones fisiológicas17. Bajo estas condiciones fueron llevados al Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores del Instituto de Biología Experimental de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela, para el aislamiento de las células madre de la pulpa dentaria humana.

1.2. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE TEJIDO PULPAR

En la campana de flujo laminar horizontal, los dientes se lavaron 3 veces con solución buffer de fosfato (PBS: de las siglas en inglés phosphate buffered solution) frío; luego sobre una placa de Petri se limpió muy bien la superficie de los dientes, eliminando el tejido blando con una cureta y nuevamente los dientes se lavaron con PBS. Seguidamente, se realizó la desinfección de la superficie con una gasa estéril impregnada con solución desinfectante, etanol al 70% 18,-21 y luego se lavaron con PBS, frío. Posteriormente, a los dientes se les realizó un surco de 0,5 a 1 mm de profundidad23 a 1 mm por debajo de la unión cemento-esmalte15 Una vez realizado el surco, los dientes se colocaron en un frasco estéril con medio F12 frío. En los casos de dientes con solo un tercio radicular formado, el tejido pulpar fue retirado por la raíz con zondas barbadas y colocado de inmediato en medio fresco, DMEM ( GIBCO™) - F12 frío. Bajo la campana de flujo laminar vertical, los dientes se fracturaron con un cincel a nivel de la ranura o surco realizado para exponer el tejido pulpar de la cámara18. El tejido pulpar se separó suavemente de la corona y la raíz 15 e inmediatamente se colocó en una pequeña cantidad de medio DMEM-F12 frío, sobre una placa de Petri, sin permitir que se secara. Posteriormente, se cortó en trozos pequeños con tijera quirúrgica fina 24.

2. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

El protocolo para el aislamiento se basa en la capacidad de las células madre mesenquimales de adherirse a los discos de cultivo y formar grupos discretos de colonias 24. Para aislar las células, el tejido pulpar se colocó en una mezcla de solución enzimática de 4 mg/mL de colagenasa tipo I (SIGMA) y 2 mg/mL de dispasa (GIBCO™) en una proporción 1:1 por 60 minutos a 37°C. La suspensión obtenida se filtró a través de un filtro de células de 70 µm. Posteriormente, la suspensión celular resultante se centrifugó durante 6 minutos a 500 g, el taco celular obtenido, se resuspendió en el medio nutritivo para células mesenquimales, compuesto por: medio DMEM y F12 suplementado con 15% de SFB (GIBCO™) 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato (Merck), 2 mM L-glutamina (Glutamax; GIBCO®), 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL de anfotericina B (GIBCO®) y fueron sembradas en placas de 4 pozos [1,9 cm2 cada pozo, (NUNC)]. Las células aisladas de la pulpa dentaria, generalmente, son sembradas a una densidad de 0,1 a 1 x 103 células / cm2 25. La viabilidad celular se determinó con el colorante de exclusión Azul Tripano y se cuantificó el número de células con un hemocitómetro (Cámara Neubauer). Los cultivos fueron incubados a 37°C, en atmósfera húmeda a un 95% de aire y un 5% de CO2. A las 24 a 48 horas se cambió el medio de cultivo, para eliminar los restos de células y células no adherentes 26. Las células se mantuvieron hasta alcanzar la semiconfluencia (80%), con cambios periódicos de medio. Obtenida la semiconfluencia, se procedió a realizar los subcultivos con el fin de amplificar la población de células; para ello las células se disgregaron con tripsina (GIBCO™) a 0,05% y EDTA (SIGMA®) a 0,2%, incubadas por 7 minutos a 37 °C. Las células fueron centrifugadas a 500 g por 6 minutos y el taco celular obtenido se resuspendió en medio de cultivo nutritivo con suero, luego las células fueron contadas en una cámara de Neubauer para sembrar nuevamente.

2.1. CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Para analizar las características morfológicas y el comportamiento in vitro de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, se realizaron observaciones bajo el microscopio invertido de contrate de fases (Olympus I X50) acoplado a una computadora con programa TV Tuner y se tomaron los registros fotográficos correspondientes. El aspecto morfológico se determinó mediante coloración de rutina May-Grünwald-Giemsa.

2.2. EXPRESIÓN DE MARCADORES ANTIGÉNICOS DE SUPERFICIE CELULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA A TRAVÉS DEL ANÁLISIS INMUNOCITOQUÍMICO

Para observar si en las poblaciones de células aisladas y cultivadas in vitro, están presentes células mesenquimales con un fenotipo indiferenciado, se utilizó la expresión de marcadores de superficie característicos de estas células, por métodos inmunocitoquímicos. Los anticuerpos utilizados fueron el anti-STRO-1 y anti-CD146 (MUC18), dos marcadores tempranos de células madre mesenquimales y el anti-CD45, un marcador específico para células hematopoyéticas, cuya expresión debe ser negativa. Las células de los subcultivos, del tercer pasaje, de pulpa dentaria humana fueron sembradas a una densidad de 2 x 104 cel/cm2 en placas de 4 pozos y cultivadas durante la noche. Las células fueron lavadas con PBS, pH 7,4, luego se fijaron con metanol por 5 minutos. Una vez transcurrido este tiempo se lavaron con PBS, seguidamente se agregó peróxido de hidrogeno a un 3% por 6 minutos, para inactivar la peroxidasa endógena. Luego se lavó con PBS, se eliminó el exceso de líquido para posteriormente realizar la incubación con el anticuerpo primario monoclonal mouse anti-STRO-1 (1:100; Invitrogen™), el anticuerpo monoclonal anti-CD146 (1:100; eBioscience) y el anticuerpo monoclonal mouse anti-humano CD45 (1: 100; Dako Denmark) por 35 minutos y se lavó con PBS, luego se evidenció la reacción del anticuerpo utilizando el Kit ABC (Vector), se colocó el anticuerpo secundario biotinilado por 30 minutos. Posteriormente se incubó el complejo estreptavidina-HRP por 30 minutos, seguido del lavado con PBS, fresco. Seguidamente, se preparó el sustrato para la peroxidasa, la Diaminobencidina (cromógeno) y se incubó por 5 a 10 minutos. Luego se lavó con agua destilada, varias veces. Por último, se contrastaron los núcleos con Hematoxilina. El Kit ABC usa un anticuerpo secundario biotinilado que se une al complejo estreptavidina- biotina- peroxidasa, el cual reacciona con el sustrato para peroxidasa (Diaminobencidina) produciendo un precipitado marrón que permitió evidenciar la unión antígeno-anticuerpo19. También se llevaron a cabo las pruebas inmunohistoquímicas en cortes histológicos de una muestra de pulpa dentaria humana, para evidenciar la expresión de estos marcadores, como un patrón de referencia. La muestra fue procesada por procedimientos histológicos de rutina.

2.3. DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE FORMACIÓN DE COLONIAS DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Para determinar la eficiencia de formación de colonias se utilizaron células del tercer subcultivo, sembradas a baja densidad [100 cel 8,8 cm2 (placa de 35mm)], por triplicado, en medio DMEM - F12, suplementado con 15% SFB, 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B. El medio nutritivo se cambió cada 4 días. A los 14 días, se realizó la evaluación de la eficiencia de la formación de colonias14,18,27. Los cultivos fueron fijados con metanol durante 5 minutos y se colorearon con Giemsa (diluido en una proporción 1: 15 con agua destilada). Grupos > 50 células se contaron como colonias14,28,29. Gronthos y col.29 en su estudio sobre la caracterización de alta pureza de las células madre mesenquimales de la médula ósea, los agregados > 50 células se contaron como unidades formadoras de colonias, mientras, que los agregados > 10 y < 50 células los contaron como racimos o grupos. De la misma manera fue considerado en la presente investigación. La eficiencia de formación de colonias se expresó en porcentaje, el número total de colonias se dividió entre el número inicial de células sembradas y el resultado se multiplicó por 100. Lo que indica el porcentaje de células capaces de formar colonias 22,27,30, la capacidad para autorrenovarse y la capacidad de propagación a baja densidad 27.


RESULTADOS

1. AISLAMIENTO, CULTIVO Y CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

Bajo las condiciones de aislamiento (disgregación enzimática) y cultivo llevadas a cabo en la presente investigación se establecieron células viables de la pulpa dentaria humana, evidenciado a través del contaje celular y la observación regular de los cultivos, con un microscopio invertido de contraste de fase. Las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, de terceros molares, mostraron un óptimo crecimiento, cultivadas en el medio DMEM-F12, suplementado con 15% de SFB, 100 ?M L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina y 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B (antibiótico-antimicótico), condiciones de cultivo descritas previamente como óptimas, para este tipo de células. El aspecto morfológico y el comportamiento in vitro de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana mostraron inicialmente, en el cultivo primario, que las células aisladas formaron colonias adherentes a partir de los 3 a 5 días, la mayoría de las células presentaron una morfología fusiforme típica de células semejantes a fibroblastos con procesos citoplasmáticos cortos, que gradualmente se extendían (Figura 1), así como, ocasionales colonias de células con morfología parecida a células endoteliales o epiteliales que desaparecieron en el curso de los sucesivos pasajes. Las células del cultivo primario lograron la confluencia a los 6 a 7 días, los subsecuentes subcultivos tendían a tener un acelerado crecimiento, por lo que los cultivos alcanzaban la confluencia en corto tiempo entre 5 a 6 días.

FIGURA 1
Establecimiento del cultivo de células mesenquimales de pulpa dentaria humana, apariencia temprana de las células, Cultivo Primario. A. Cuatro días de cultivo, una colonia B. Siete días de cultivo, colonias de mayor tamaño, células fusiformes y estrelladas. Contraste de fase. 100x

A partir del tercer subcultivo, se obtuvo una población más homogénea (Figura 2), basado en la morfología de las células, características de células semejantes a fibroblastos con extensiones citoplasmáticas, núcleo ovalado, central con varios nucléolos, que permanecieron hasta el decimo octavo pasaje. Sin embargo, se pudo evidenciar que la mayor proliferación celular se observó entre el sexto, séptimo y octavo subcultivo. Se observó que en el sexto y séptimo subcultivos además de la gran proliferación celular, la formación de agregados de células, del cual se irradian las células paralelas unas a otras. Las células cercanas al agregado celular se observan estrechamente unidas y pierden su morfología fusiforme y adquieren una morfología cuboides, posiblemente asociado a una diferenciación espontanea hacia el linaje osteogénico. (Figura 3). Mientras que en el resto del cultivo las células conservaron su morfología fusiforme semejante a fibroblastos. En los siguientes subcultivos no se observaron aparentemente cambios morfológicos de las células asociados a la diferenciación y senescencia.

FIGURA 2
Establecimiento del cultivo de células mesenquimales de pulpa dentaria humana. Tercer subcultivo, cultivo confluente, población de células morfológicamente más homogéneas, células fusiformes, células en división (flecha). 200x

FIGURA 3
Cultivo de células mesenquimales de pulpa dentaria humana en monocapa. Sexto subcultivo: A. Formación de agregado celular (flecha).40x; B. Células de la periferia del agregado con morfología fusiforme (*) y hacia el centro células estrechamente agrupadas cuboides (*).Contraste de fase. 100x

2. EXPRESIÓN DE MARCADORES ANTIGÉNICOS DE SUPERFICIE CELULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA A TRAVÉS DEL ANÁLISIS INMUNOCITOQUÍMICO

La identificación de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana a través del análisis inmunocitoquímico de los cultivos de las células mesenquimales de la pulpa dentaria, se realizó utilizando los anticuerpos anti-STRO-1, anti-CD146/MUC18 y el anti-CD45. Las células aisladas de la pulpa dentaria de terceros molares, del tercer pasaje, expresaron moléculas de superficie celular STRO-1 (marcador de células mesenquimales) y CD146/MUC18 (marcador de células endoteliales) "positivas", considerados dos marcadores tempranos de células madre mesenquimales, mientras el marcador específico para células hematopoyéticas, el CD45 (antígeno común de leucocitos) fue "negativo". La ausencia de expresión de este marcador, indica que en las células aisladas de la pulpa, no están presentes progenitoras hematopoyéticas. Se demuestra que estas células no derivan de fuentes hematopoyéticas sino son de origen mesenquimal. Estos resultados fueron consistentes para las distintas líneas celulares. Las células "positivas" a las moléculas de superficie STRO-1 y CD146/MUC18 en las poblaciones de células aisladas, expresaron diferentes niveles de intensidad de expresión desde leve, moderada e intensa. Los marcadores no fueron uniformemente expresados, se encontraron en subgrupos de células, indicando que la población de células madre de pulpa dentaria es heterogénea. La morfología de las células que expresaron STRO-1 y CD146 "positivo" varió entre fusiforme, fusiformes con citoplasma ancho y formas no definidas. La presencia de células marcadas con STRO-1+, CD146+ y CD45-, confirma la existencia de células madre o progenitoras en las poblaciones de células de la pulpa dentaria humana aisladas. (Tabla 1). También, se llevaron a cabo las pruebas inmunohistoquímicas en cortes histológicos de una muestra de pulpa dentaria humana, se observó marcaje en la zona perivascular con el STRO-1+ y CD146/MUC18+, mientras que no se observó marcaje con el anticuerpo anti- CD45, el cual fue negativo.

Tabla I
Expresión de los marcadores STRO-1, CD146 y CD45 en las células mesenquimales de pulpa dentaria aisladas y el tejido pulpar de humano, por técnica inmunohistoquímica
STRO-1 (marcador de células mesenquimales), CD146 (marcador de células endoteliales), CD45 (antígeno común de leucocitos); + marcaje positivo, - marcaje negativo, * intensidad variable

3. DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE FORMACIÓN DE COLONIAS DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES DE LA PULPA DENTARIA HUMANA

En los cultivos en monocapa de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas, las células fueron capaces de formar colonias a baja densidad. Las colonias estaban formadas por numerosas células adherentes, la morfología de las células típica de fibroblastos, fusiformes, alargadas, con un citoplasma claro y un núcleo ovalado central con varios nucléolos, que identifica la CFU-F. Demostrando su capacidad de renovación y eficiencia de formación de colonias. Sin embargo, la eficiencia de formación de colonias expresada en porcentaje, varió entre las diferentes líneas celulares. Las líneas celulares sembradas a una densidad de 100 células por placa de 35 mm (8,8 cm2) formaron colonias ? 50 células, al calcular la eficiencia de formación de colonias se obtuvieron los siguientes resultados 18,3%, 15,6%, 42% de células capaces de formar colonias, además de los agregados de 10 a 40 células.


DISCUSIÓN

El objetivo general del presente trabajo de investigación es establecer el cultivo de las células madre mesenquimales de la pulpa dentaria humana. Sin embargo, la inducción a la diferenciación hacia diferentes linajes será publicado posteriormente, para cumplir con los criterios mínimos, para identificar a las células madre en la población de células aisladas. El primer obstáculo para el establecimiento exitoso del cultivo de las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana fue la desinfección de los dientes para prevenir la contaminación. El protocolo para la desinfección utilizado, como se describió en materiales y método incluía el lavado con PBS y la desinfección con alcohol al 70% 18-21. Sin embargo, Perry y col.31 recomiendan un protocolo adaptado del banco de cornea, para remover las bacterias y de esta manera no perder los cultivos por contaminación bacteriana. Sería recomendable realizar un estudio comparativo entre ambos protocolos, para determinar la efectividad de cada uno de ellos. Se seleccionaron terceros molares retenidos por ser un tejido descartable 22. El germen de los terceros molares comienza su desarrollo alrededor de los 6 años de edad. Hasta ese momento, el tejido embrionario de la lámina dentaria permanece inactivo e indiferenciado en los maxilares del niño. Aunque, la mineralización de la corona comienza durante los 8 años de edad, frecuentemente sus raíces están incompletamente formadas a la edad de 18 años. Esto significa que la estructura de estos dientes es inmadura a esta edad y una población de células indiferenciadas reside en la zona rica en células de la pulpa del germen dentario, necesarias para el desarrollo completo del diente 32. Por lo que los terceros molares pueden representar un origen valioso de células madre de pulpa dentaria humana. Para la obtención del tejido pulpar el calentamiento de los dientes mientras se cortan puede producir daño al tejido pulpar25. Suchánek y col.33 señalan que ellos no lograron aislar células madre de la pulpa dentaria, de dientes donde se separó la corona cortando en capas finas, sin enfriamiento, los autores suponen que la pulpa dentaria sufrió recalentamiento y un severo estrés mecánico, además lo consideran un método con un alto riesgo de contaminación. Mientras que si fueron capaces de aislar las células utilizando un fórceps Luer´s para fracturar las raíces y extraer la pulpa a través del conducto radicular o si la raíz no estaban completamente desarrolladas el foramen era ampliado y se extirpa la pulpa con una aguja por apical. En el presente trabajo para mantener la viabilidad de las células durante el corte de los dientes, se conservaron a baja temperatura y condiciones de humedad constante25 y en los casos de dientes con solo un tercio radicular formado, el tejido pulpar fue retirado por la raíz con zondas barbadas y colocado de inmediato en medio fresco, DMEM - F12 frío. Para el aislamiento de las células mesenquimales de la pulpa dentaria, la mayoría de los investigadores18,19,21,26,29,34-48 utilizan el método de disgregación enzimática, descrito por Gronthos y col.14. Igualmente, en el presente estudio se seleccionó este método, porque se consigue un gran número de células aisladas en corto tiempo y más representativo del tejido, que con las técnicas por explantes35,47 Para el cultivo de las células madre mesenquimales de pulpa dentaria la mayoría de los investigadores18,19,21,22,26,75,29,48-52 utilizan el medio ?-MEM propuesto por Gronthos y col.14 y también es ampliamente utilizado el medio DMEM,39,45,53-56, con el que, igualmente, se obtiene un óptimo crecimiento celular. Sin embargo en el presente estudio se utilizó el medio DMEM-F12 que también proporciona buenos resultados41 y se ha utilizado en el laboratorio, en el protocolo para el cultivo de otros tipos de células 57. En la presente investigación las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana, de terceros molares, mostraron un óptimo crecimiento, cultivadas en medio DMEM-F12, suplementado con 15 % de SFB, 100 μM L-ácido ascórbico 2-fosfato, 2 mM L-glutamina y 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 2 µg/mL anfotericina B (antibiótico-antimicótico), condiciones de cultivo descritas previamente como óptimas.

Las células mesenquimales de la pulpa dentaria humana aisladas, mostraron la morfológica típica de fibroblastos, células fusiformes con finas extensiones citoplasmáticas, lo que coincide con numerosas investigaciones 14,19,20,36,58 y es análoga a la progenie de la médula ósea humana 14. La cual se mantuvo durante los sucesivos pasajes. Sin embargo, en 3 de 4 líneas celulares que se sometieron a más de 6 subcultivos, además de la gran proliferación celular se observó la presencia de algunos agregados celulares en el sexto, séptimo y octavo subcultivo.

Las células cercanas al agregado mostraron algunos cambios morfológicos sugerentes a una posible diferenciación espontánea. Mientras que en el resto del cultivo las células conservaban su morfología fusiforme semejante a fibroblastos. La diferenciación espontánea de las células madre de pulpa dentaria sin añadir un medio inductor fue descrita por Alliot-Licht y col.59, los autores refieren que la transformación espontanea del fenotipo celular puede ocurrir durante el cultivo. El proceso de mineralización ocurrió en ausencia de dexametasona y ?-GP. Los nódulos mineralizados fueron observados en cultivos primarios con largo tiempo de cultivo y en subcultivos del quinto pasaje. También, Tsukamoto46 observó que las células de la pulpa de dientes temporales humanos, formaron nódulos mineralizados cuando crecieron en medio de cultivo en ausencia de medios inductores. La matriz formada en estos nódulos se tiñó fuertemente con von Kossa. Alrededor y entre estos nódulos las células fibroblásticas formaron una monocapa regular. Los autores observaron que la formación de nódulos mineralizados depende de la capacidad de las células para formar multicapas, in vitro. La ausencia del contacto inhibitorio parece esencial para proveer la estructura tridimensional que es necesaria para obtener un tejido mineralizado.

Para el análisis de la expresión de antígenos de superficie de las células mesenquimales de pulpa dentaria humana, a través de técnicas inmunocitoquímicas, para demostrar la presencia de células madre mesenquimales en la población de células aislada, se seleccionaron los anticuerpos anti- STRO-1, anti-CD146 y anti-CD45. Los resultados mostraron que las células aisladas de pulpa dentaria, del tercer pasaje expresaron moléculas de superficie celular STRO-1 y CD146 "positivos", también presentes en estudios previos en células madre mesenquimales de médula ósea 60 y en células madre de pulpa dentaria humana de dientes permanentes 14,21,61 y en dientes temporales exfoliados 36 mientras, el marcador específico para células hematopoyéticas, el CD45, que reconoce el antígeno común de leucocito, monocitos y subgrupos de células T, fue "negativo". La ausencia de expresión de este marcador, indica que en las células aisladas de la pulpa, no están presentes progenitoras hematopoyéticas 36 y coincide con los resultados de otras investigaciones14,18,21,38. En particular, el STRO-1 es extremadamente importante en la selección de las células madre de la pulpa dentaria, solo las células STRO-1+ son capaces de diferenciarse en células semejantes a odontoblastos, lo que indica la importación de estas células en el proceso de reparación 39. Las células madre contenidas en los cultivos de células de la pulpa dentaria expresan CD146, marcador de células de músculo liso, células endoteliales y pericitos, lo que indica que estas células pueden ser originadas de un microambiente perivascular 36. Los autores 62 observaron que ambos anticuerpos el anti-STRO-1 y el anti-CD146 marcaban las mismas poblaciones celulares precursoras. En los cortes histológicos de la muestra de tejido pulpar las células localizadas alrededor de los vasos sanguíneos de la pulpa dentaria fueron positivas al STRO-1 y al CD146 (MUC18), por técnica inmunohistoquímica, confirmando las observaciones que señalan que las células madre de la pulpa dentaria pueden ser originadas de un microambiente perivascular 36,63.

En la determinación de la eficiencia de formación de colonias de las células mesenquimales de pulpa dentaria humana se observó que al sembrar 100 células por placa se formaron numerosas colonias. Se evidenció una estrecha relación entre el número de células cultivadas y el número de colonias fibroblásticas que se desarrollaron, esto coincide con las observaciones realizadas por Friedenteins 29 en el cultivo de células mesenquimales de médula ósea. La formación de colonias ocurre solo cuando la siembra se desarrolla a una cierta densidad inicial óptima de células, en caso de excesivo número de células por unidad de superficie los fibroblastos forman una monocapa, mientras en caso de insuficiente densidad ellas fallan en crecer. Establecer la EFC-F resulta en una correlación lineal entre el número de colonias y el número de células sembradas 64.

En el presente estudio, en las poblaciones de células aisladas se identificaron células con características de células madre mesenquimales, como su capacidad de adherirse a las placas de cultivo, formar colonias altamente proliferativas, su morfología fusiforme y la expresión consistente de marcadores de superficie que caracteriza células madre mesenquimales adultas de pulpa dentaria. Sin embargo, faltaría determinar su capacidad de diferenciación para cumplir con los criterios básicos para definirlas como células madre.


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
  1. Weissman IL. Stem cells: units of development, unit of regeneration, and units in evolution. Cell 2000; 100(7): 157- 168.

  2. Donovan PJ, Gearhart J. The end of the beginning for pluripotente stem cells. Nature 2001; 414: 92- 97.

  3. Gokal P. What are stem cells? 2004: Dec;1-13. (Fecha de consulta Octubre, 2008).http://www.csa.com/discoveryguides/stemcell/overview.php

  4. Wagers AJ, Weissman IJ. Plasticity of stem cells. Cell 2004; 116(5): 639- 648.

  5. The stem cell. In Stem Cell Information (World Wide Web site). Bethesda, MD: National Institutes of Health, U.S. Department of Health and Human Services, 2006 Available at http://stemcells.nihgov/info/scireport/chaper1 (Fecha de consulta Sabado, Octubre 18, 2008)

  6. Rodríguez V. Células madre: conceptos generales y perspectivas de investigación. Universitas Scientiarum 2005; 10(1): 5-14.

  7. Krebsbach PH, Robey PG. Dental and skeletal stem cells: potential cellular therapeutics for craniofacial regeneration. J Educ 2002; 66(6): 766-733

  8. Prentice DA. Adult stem cells. 2003 Fecha de consulta Octubre, 2008. http://www.stemcellresearch.org/org/old/Prentice-AdultStemCells.pdf

  9. The adult stem cell. In Stem Cell Information (World Wide Web site). Bethesda, MD: National Institutes of Health, U.A. Department of Health and Human Services, 2006 Available at (Fecha de consulta Sabado Octubre 18, 2008) http://stemcells.nihgov/info/scireport/chaper4.

  10. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999 284(2): 143- 147.

  11. Robey PG. Stem cells near the century mark. J Clin Invest 2000; 105: 1489- 1491.

  12. Frisén J. Stem cell plasticity? Neuron 2002; 35: 415- 418.

  13. Merentes E. Fuentes de obtención de células madre mesenquimales. Potencialidad de diferenciación, in vitro. Trabajo de ascenso a Titular. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias. Instituto de Biología Experimental. Laboratorio de cultivo de Tejidos y Biología de Tumores. Caracas, 2009.

  14. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Gehron P, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(25):13625-13630.

  15. Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher, Cherman N, Boyde A, DenBesten P, Gehron Robey P, Shi S. Stem cell properties of human dental pulp stem cell. J Dent Res 2002; 81(8):531-535.

  16. Morsczeck C, Schmalz G, Reichert TE, Vo?llner F, Galler K, Driemel O. Somatic stem cells for regenerative dentistry. Clin Oral Invest 2008: 12; 113- 118.

  17. Bello G, Merentes E, Arvelo F. Cultivo de queratinoscitos humanos in vitro. Gac Méd 1998; 106(4): 491-495.

  18. Huang AHC, Chen YK, Chan AWS, Shieb TY, Lin LM. Isolation and characterization of human dental pulp stem/stromal cells from nonextracted crown-fractured teeth requiring root canal therapy. J Endod 2009; 35(5): 673- 681.

  19. Zhang W, Walboomers XF, Wolke JGC, Bian Z, Fan MW, Jansen JA. Differentiation Ability of rat postnatal dental pulp cells in vitro. Tissue Eng 2005; 11(3/4): 357- 368.

  20. Mauth C, Huwig A, Graf-Hausner U, Roulet J-H. Restorative applications for dental pulp therapy. Topics in Tissue Engineering 2007; 3. Eds Ashammakhi N, Reis R, Chiellini E©.

  21. Wei X, Ling J, Wu L, Liu L, Xiao Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J Endod 2007; 33(6): 703- 708.

  22. Huang AHC, Chen YK, Chan AWS, Shieb TY, Lin LM, Shieh TY, Cha AWS. Isolation and characterization of dental pulp stem cells from a supernumerary tooth. J Oral Pathol Med 2008; 37: 571- 574.

  23. Nakashima M. Establishment of primary cultures of pulp cells from bovine permanent incisors. Arch Oral Biol 1991; 36(9): 655- 663.

  24. Kumabe S, Nakatsuka M, Kim G, Jue S, Aikawa F, Shin J, Iwai Y. Human dental pulp cell culture and cell transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anat. Jpn 2006; 82(4): 147-156.

  25. Sonoyama W, Yamaza T, Gronthos S, Shi S. Multipotent stem cells in dental pulp. En Freshney RI, Stacey GN, Auerbach JM editors. Culture of human stem cells. Wiley, New Jersey 2007:187-206.

  26. Mohd AB, Fazliah SN, Fadilah A, Asma H, Siti AR, Shaharum S, Jaafar S, Asiah AB, Shamsuria O. Stem cells from childrens´teeth. Archs Oral Sciences 2008: 3(1); 29- 31.

  27. Cheng PH, Snyder B, Fillos D, Ibegbu CC, Hung A, Chan A. Postnatal stem/progenitor cells derived from the dental pulp of adult chimpanzee. BMC Cell Biology 2008; 9(20):1-11.

  28. Gronthos s, Zannettino ACW, Hay SJ, Shi S, Graves SE, Kortesidis A, Simmons PJ. Molecular and cellular characterization of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J Cell Sci 2003; 116: 1827- 1835.

  29. D´Aquino R, Graciano A, Sampaolesi M, Laino G, Pirozzi G, De Rosa A, Papaccio G. Human postnatal dental pulp cells co-diferentiate into osteblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ 2007; 14: 1162-1171.

  30. Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA, Rudakow. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro.colony assay method. Exp Hemat 1974; 2: 83- 92.

  31. Perry BC, Zhou D, Wu X, Yang FC, Byers MA, Chu TMG, Hockema JJ, Woods EJ, Goebel WS. Collection , cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal Stem cells for banking and clinical use. Tissue Eng 2008; 14(2): 149-156.

  32. D´Aquino R, De Rosa A, Laino G, Caruso F, Guida L, Rullo R, Checchi V, Laino L, Tirino V, Papaccio G. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J Exp Zool (Mol Dev Evol) 2008; 310B: 1- 8.

  33. Sonoyama W, Liu Y, Yamaza T, Tuan RS, Wang S, Shi S, Huang GTJ. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. J Endod 2008; 34(2): 166- 171.

  34. Baghaban MR, Nazarian H, Shariati M, Vahabi S. Human dental pulp stem cells: the culture optimization for increased growth. IJHOSCR 2009; 3(4): 5- 13.

  35. Nakamura S, Yamada Y, Katagiri W, Sugito T, Ito K, Ueda M. Stem cell proliferation pathways comparison between human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells by gene expression profile from promising dental pulp. J Endod 2009; 35(11): 1536- 1542.

  36. Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Robey LW, Shi S. SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci USA 2003 May 13; 100(10): 5807-5812.

  37. Huang G TJ, Sonoyama W, Chen J, Park SH. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res 2006; 324: 225- 236.

  38. Laino G, d' Aquino R, Graziano A, Lanza V, Carinci F, Naro F, Pirozzi G Papaccio G. A new population of human adult dental pulp stem cells: a useful source of living autologous fibrous bone tissue (LAB). J Bone Miner Res 2005;20: 1454-1402.

  39. Baghaban MR, Vahabi S, Shariati M, Nazarian H. In vitro growth and characterization of stem cells from human dental pulp of deciduous versus permanent teeth. Journal of Dentristry, Tehran University of Medical Sciences 2010: 7(4); 185- 195.

  40. Yokose S, Kadokura H, Tajima Y, Fujieda K, Katayama I, Matsuoka T, Katayama T. Establishment and characterization of a culture system for enzymatically released rat dental pulp cells. Calcif Tissue Int 2000; 66: 139-144.

  41. Nakashima M. Establishment of primary cultures of pulp cells from bovine permanent incisors. Arch Oral Biol 1991; 36(9): 655- 663.

  42. Kasugai S, Shibata S, Suzuki S, Ogura H. Characterization of a system of mineralized-tissue formation by rat dental pulp cells in culture. Arch Oral Biol 1993; 38(9): 769- 777.

  43. Liu L, Ling J, Wei X, Wu L, Xiao Y. Stem cell regulatory gene expression in human adult dental pulp and periodontal ligament cells undergoing odontogenic/osteogenic differentiation. J Endod 2009; 35(10): 1368- 1376.

  44. Fujiwara S, Kumabe S, Iwai Y. Isolated rat dental pulp cell culture and trasplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anat Jpn 2006; 83(1): 15-24.

  45. Kumabe S, Nakatsuka M, Kim G, Jue S, Aikawa F, Shin J, Iwai Y. Human dental pulp cell culture and cell transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anat. Jpn 2006; 82(4): 147-156.

  46. Tsukamoto Y, Fukutani S, Shin-ike T, Kubota T, Sato S, Suzuki Y, Mori M. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Archs Oral Biol 1992,37(12): 1045-1055.

  47. Alliot-Licht B, Bluteau G, Magne D, Lopez-Cazaux S, Lieubeau B, Daculsi G, Guicheux J. Dexamethasone stimulates
    differentiation of odontoblast-like cells in human dental pulp cultures. Cell Tissue Res 2005; 321: 391- 400.

  48. Lopez-Cazaux S, Bluteau G, Magne D, Lieubeau B, Guicheux J, Alliot-Licht B. Culture medium modulates the behaviour of human dental pulp-derived cells: technical note. Eur Cell Mater 2006; 11: 35- 42.

  49. Freshney RI. Culture of animal cells. A manual of basic tecnhique. 4ta ed. Editorial Wiley-Liss. Canada; 2000.

  50. Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med 2004; 8(3): 301-31

  51. Zhang W, Walboomers XF, van Kuppevelt TH, Daamen WF, Bian Z, Jansen JA. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials 2006; 27: 5658- 5668.

  52. Papaccio G, Graziano A, DÁquino R, Graziano MF, Pirozzi G, Menditti D, De Rosa A, Carinci F, Laino G. J Cell Physiol 2006; 208: 319-325.

  53. Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Lalykina KS. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet 1970; 3: 393-403.

  54. Bohl K, Shon J, Rutherford B, Mooney DJ. Role of synthetic extracellular matrix in development of engineered dental pulp. J Biomater Sci Polymer Edn 1998; 9(7): 749- 764.

  55. Kuo MYP, Lan WH, Lin SK, Tsal KS, Hahn LJ. Collagen gene expression in human dental pulp cell cultures. Archs Oral Biol 1992; 37(11): 945- 952).

  56. Baum BJ, Mooney DJ. The impact of tissue engineering on dentistry. J Am Dent Assoc 2000; 131: 309- 318.

  57. Márquez ML, Hernández A, Scioscia D, Merentes E. Cultivo de células de cartílago nasal humano. Gac Méd Caracas 2012;120(1): 48-54.

  58. Takeyasu M, Nozaki T, Watanabe M, Shinohara M, Morita J, Hidaka A, Iwamoto K, Takahashi T, Nagata S, Daito M, Ohura K. In vitro osteogenic differentiation potential of dental pulp stem cells. J Oral Tissue Eng 2004;2(1): 25-30.

  59. Alliot-Licht B, Hurtrel D, Gregoire M. Characterization of ?-smooth mucle actin positive cells in mineralized human dental pulp cultures. Archs Oral Biol 2001; 46: 221-228.

  60. Iohara K, Zheng L, Ito M, Tomokiyo A, Matsushita K, Nakashima M. Side population cells isolated from porcine dental pulp tissue with self-renewal and multipotency for dentinogenesis, chondrogenesis, adipogenesis, and neurogenesis. Stem Cells 2006; 24(11): 2493-2503.

  61. Nam S, Won JE, Kim CH, Kim HW. Odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells stimulated by the calcium phosphate porous granules. Journal of Tissue Engineering 2011. Article ID 812547,10 pages. DOI: 10.4061/2011/812547. Fecha de consulta 2 de Abril 2011.

  62. Filshie RJ, Zannettino AC, Makrynikola V, Gronthos S, Henniker AJ, Bendall LJ, Gottlieb DJ, Simmons PJ, Bradstock, KF. MUC18, a member of the immunoglobulin superfamily, is expressed on bone marrow fibroblasts and a subset of hematological malignancies. Leukemia 1998; 12: 414- 421.

  63. Shi S, Gronthos S. Perivascular niches of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J Dent Miner Res 2003; 18: 696- 704.

  64. Friedenstein AJ. Stromal mechanisms of bone marrow: cloning in vitro and retransplantation in vivo. Haematol Blood Transfus 1980; 25: 19- 29.