Trabajos Originales

Estudio Citomorfométrico de pacientes con Cáncer y desórdenes potencialmente malignos de la cavidad bucal

Recibido para Arbitraje:31/10/2011
Aceptado para Publicación: 17/02/2.012


  • Juan Ignacio Dericia: Alumno de Tercer año de la Carrera de Odontología y Becario. Facultad de Odontología. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina.

  • Ignacio Gonzalez Segura: Alumno de Tercer año de la Carrera de Odontología. Facultad de Odontología. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina.

  • Maria Brezzo: Odontologa. Profesor asistente Cátedra de Clínica Estomatológica. Facultad de Odontología. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina.

  • Luis Marcelo Croharé: Ingeniero en Electrónica. Responsable del Laboratorio de Microscopía y Procesamiento de Imágenes. Área de Biología Odontológica. Facultad de Odontología. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina

  • Dante Gustavo Secchi: Odontólogo. Profesor asistente Cátedra de Clínica Estomatológica. Jefe de Consultorio Externo. Facultad de Odontología. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina.

  • Alicia Inés Malberti: Dra. en Ciencias Biológicas. Profesor asistente Cátedra de Histología y Embriología. Facultad de Odontología. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina.

  • Ana Maria Zarate: Doctora en Ciencias de la Salud. Profesor adjunto Cátedra de Biología Celular. Facultad de Odontología.
CORRESPONDENCIA: Universidad Nacional de Córdoba. azgelfo@hotmail.com. Dirección: Haya de la Torre s/n. Ciudad Universitaria. Córdoba. Argentina

ESTUDIO CITOMORFOMÉTRICO DE PACIENTES CON CÁNCER Y DESÓRDENES POTENCIALMENTE MALIGNOS DE LA CAVIDAD BUCAL

RESUMEN.
La detección temprana de lesiones bucales promete aumentar sobrevivencia y reducir la morbilidad de los pacientes que sufren esta condición. Un método alternativo para el examen de lesiones en la cavidad bucal, es la citología. Objetivo: valorar las relaciones del tamaño núcleo/citoplasma de células de mucosa bucal sana, de lesiones bucales potencialmente malignas y de cáncer bucal, obtenidas con citología exfoliativa utilizando citomorfometría. Material y método: Se realizó citología a 22 pacientes, de ambos sexos, con edades entre 23 y 81 años utilizando cytobrush. Las muestras se dividieron en tres grupos: 1) citologías de pacientes con lesiones de cáncer bucal (n=7); 2) citologías de pacientes con desórdenes bucales potencialmente malignos (leucoplasia y líquen) (n=15); 3) citologías del lado sano de pacientes con lesiones de cáncer y desórdenes bucales potencialmente malignos (grupo control) (n=15). Se seleccionaron 30 células de cada paciente y se midió el área nuclear (AN), la citoplasmática (AC) y se calculó la relación AN/AN. Se utilizó el Test de Kruskal Wallis y el Sofware estadístico Infostat. Resultados: No se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos estudiados al valorar la relación AN/AC. Teniendo en cuenta el género, se observó que en las mujeres se diferenciaron significativamente las células del grupo control de las de los grupos de lesiones. En el género masculino se observaron diferencias significativas entre los tres grupos celulares. No hubo diferencias significativas entre los diferentes grupos etarios .Discusión: A pesar de las diferencias significativas entre los géneros, no es posible hacer una buena separación de los tres grupos de estudio, utilizando solamente citología exfoliativa.

PALABRAS CLAVE: cáncer bucal, lesiones precancerosas, citología exfoliativa, citomorfometría.



CITOMORPHOMETRIC STUDY OF PATIENTS WITH CANCER AND POTENTIALLY MALIGNANT DISORDERS OF THE ORAL CAVITY

ABSTRACT
Early detection of bucal lesions promises to increase survival and to reduce morbidity in patients suffering from this condition. An alternative method for examining lesions in the bucal cavity is cytology. Objective: To assess by cytomorphometry the relationship of size nucleus / cytoplasm of superficial cells from healthy bucal mucosa, from potentially malignant bucal disordes lesions and bucal cancer using exfoliative cytology. Material and methods: PAP smear was performed in 22 patients of both gender, aged between 23 and 81. Cytobrush was used. The samples were divided into three study groups: 1) smears of patients with bucal cancer lesions (n = 7), 2) smears of patients with potentially malignant bucal disordes lesions (n = 15), lesions considered were leukoplakia and lichens ; 3) (control group) (n=15): smears of the healthy side of patients with cancer and potentially malignant bucal disordes lesions.Thirty cells were selected for each patient and the nuclear area (NA), cytoplasmic area (CA) were measured and the ratio NA / CA was calculated. We used Kruskal Wallis and Statistical Software InfoStat. Results: No significant differences were found between the three groups studied the relationship NA / CA was assesed . When comparing cells from each of the three groups considering the gender of the patients separately, we found that in women differ significantly from the control group cells and groups of injuries, we could not discriminate between cells obtained from potentially malignant bucal disordes lesions and cancer lesions . In the male gender differences were significant among the three cell groups. Discusion: Despite the significant gender differences, we could not difference the three study groups using only exfoliative cytology.

Key words: bucal cancer, precancerous lesions, exfoliative cytology, cytomorphometry.


INTRODUCCIÓN

El cáncer bucal (CB) es la neoplasia maligna más frecuente en la región de cabeza y cuello, siendo el carcinoma de células escamosas el que presenta mayor incidencia. Una parte significativa de estos cánceres se desarrolla a partir de desórdenes bucales potencialmente malignos (DOPM) como la leucoplasia 1.

Las tasas de curación del CB dependen en general del estadío de detección del mismo. Esto es importante, porque tiene una influencia significativa sobre el plan de tratamiento y el pronóstico del mismo. Los pacientes con carcinomas bucales de células escamosas tienen una tasa de supervivencia del 80% en estadíos iniciales dentro de los 5 años, del 40% en neoplasias con afectación regional, y menos del 20% en metástasis a distancia; esto no ha mejorado en los últimos 30 años 2.

Una de las principales causas del fracaso en el tratamiento del carcinoma de células escamosas es que una proporción significativa de estos casos no son diagnosticados o tratados hasta que alcanzan un estado avanzado de desarrollo. Esto se debe a que los pacientes habitualmente no reportan características inusuales en su boca y muchos profesionales de la salud no investigan a fondo las lesiones observables 3. La detección precoz en estadíos asintomáticos garantiza no sólo un aumento en las tasas de supervivencia, sino también una mejor calidad de vida, como consecuencia de tratamientos menos agresivos y mutilantes. Además posibilita aumentar la sobrevivencia y disminuir la morbilidad de los pacientes que sufren esta condición.

Los métodos diagnósticos clásicos para las lesiones de CB y DOPM son el examen clínico y el estudio histopatológico del material obtenido por biopsia. El análisis histológico de las biopsias es todavía la técnica más aceptada para determinar de un modo fiable la naturaleza de las lesiones de la mucosa bucal1,4. Pero la toma de las mismas es una prueba cruenta que implica actuar quirúrgicamente, con limitaciones técnicas para algunos profesionales y con implicaciones de orden psicológico en ciertos pacientes.

Actualmente, un método alternativo para el examen de lesiones en la cavidad bucal es la citología exfoliativa (CE). Se trata de una técnica no agresiva que en general es bien aceptada por los pacientes, constituyendo por lo tanto una opción atractiva para el diagnóstico temprano del CB3,5. Esta metodología es utilizada en programas preventivos de salud pública a fin de evaluar riesgos de cáncer genital en la población. Debido a que la cavidad bucal es fácil de examinar y los factores de riesgo para el cáncer bucal son conocidos, existiría una gran oportunidad para aumentar los buenos resultados de los pacientes a través del diagnóstico y tratamiento de lesiones premalignas antes de que se desarrolle un carcinoma bucal invasivo 6. Sin embargo, la CE aún no se ha establecido fehacientemente como técnica de monitoreo de la mucosa bucal tal como ha ocurrido en el cáncer de útero 7.

Odgen et al 8 sugieren que las técnicas cuantitativas utilizando CE y basadas en la valoración de parámetros tales como las variaciones del tamaño del núcleo y el citoplasma, pueden ser de utilidad para el diagnóstico precoz del cáncer bucal ya que las mismas son objetivas, precisas y reproducibles. Se ha demostrado que la citología exfoliativa es capaz de detectar cambios malignos basándose en la determinación del área del núcleo y del citoplasma en frotis teñidos con coloración de Papanicolau (PAP).9

Aunque la biopsia es aún la técnica clásica más aceptada para el diagnóstico definitivo del CB, el desarrollo de dispositivos automáticos citomorfométricos ha hecho resurgir el interés en la CE. La estandarización de la misma podría llevar a reducir la necesidad de múltiples biopsias en pacientes que requieren seguimiento a largo plazo 10 y a realizar controles periódicos de pacientes de riesgo como son los fumadores, bebedores y los expuestos a altos niveles de contaminación ambiental3,7.

En este trabajo nos propusimos determinar las diferencias en la relación de tamaño del área nuclear/área citoplasmática de las células obtenidas, por citología exfoliativa , de mucosa bucal sana, de lesiones de cáncer bucal y de lesiones de desórdenes potencialmente malignos.


MATERIAL Y MÉTODO

El trabajo se llevó a cabo realizando CE en pacientes que asistieron al consultorio externo de la Cátedra de Estomatología Clínica"A" de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. A cada uno de ellos se le realizó su historia clínica, incorporando datos de nombre, edad, género, ocupación, hábitos y antecedentes familiares. Previo a la intervención, los pacientes firmaron el consentimiento informado correspondiente.

Los pacientes (n=22) fueron varones (n=15) y mujeres (n=7), con edades comprendidas entre 23 y 81 años. Las muestras obtenidas se dividieron en tres grupos de estudio:

  • Grupo 1: citologías de pacientes con lesiones de cáncer bucal. (n=7). De estas lesiones, tres correspondieron al género femenino y cuatro al masculino. (Figura 1 A y B).

    Figura. 1
    A. Lesión de cáncer de paciente de 48 años, género femenino. B. Citología exfoliativa de la lesión (H/E 400x).

  • Grupo 2: citologías de pacientes con desórdenes bucales potencialmente malignos (n=15); la lesiones consideradas fueron leucoplasias y líquenes. De estas lesiones cuatro correspondieron al género femenino y once al género masculino. (Figura 2 A, B).

    Figura 2:
    A. Lesión de leucoplasia de 40 años, género masculino. B. Citología exfoliativa de la lesión (H/E, 400x).C. Citología exfoliativa del lado opuesto a la lesión (PAP , 200x)

  • Grupo 3 (grupo control): citologías del lado sano de pacientes con lesiones de cáncer y desórdenes bucales potencialmente malignos. (n=15). (Figura 2 C)


Citologías exfoliativas (Fig.3)

Las muestras se obtuvieron con cepillo colector citológico cytobrush (Medibrush®, Medical Engineering, Buenos Aires, Argentina). Se fijaron con alcohol 96% durante 2 h; posteriormente, las muestras de los grupos 1 y 2 se colorearon con la técnica de H/E y PAP.

Figura 3:
Citología exfoliativa realizada con cepillo colector citológico cytobrush (Medibrush®, Medical Engineering, Buenos Aires, Argentina).

Estudios citomorfométricos (Fig.4)

Una vez coloreados los extendidos, se seleccionaron treinta células de cada paciente, y a cada una de ellas se les midió el área nuclear (AN) y el área citoplasmática (AC), y luego se calculó la relación AN/AN. Solo las células claramente definidas fueron medidas. En todos los casos el área citoplasmática y el área nuclear se expresaron en micrómetros, a 400x. Todas las muestras fueron analizadas por la misma persona, utilizando un microscopio Olympus BX-50 (400X), conectado a cámara de video Sony SCD-970. Se utilizó analizador de imágenes Image Pro Plus (versión 4.52), manejado siempre por el mismo operador .El perímetro nuclear y el citoplasmático fueron trazados utilizando cursor digital; el AN, el AC y la relación N/C fueron calculados automáticamente por el software.

Figura 4.
Citomorfometría de extendido de células de mucosa bucal, realizada conmicroscópio Olympus BX-50 (400x), conectado a cámara de video Sony SCD-970 .Se utilizó analizador de imágenes Image Pro Plus (versión 4.52)

Análisis estadísticos:

Se utilizó Test de Kruskal Wallis y Sofware estadístico Infostat.
Se compararon las medias de la relación AN/AC de los tres grupos de estudio y, por otro lado, se tuvieron en cuenta los parámetros de género y edad. En este último caso se consideraron los siguientes grupos etarios: A. menos de 45; B. entre 46 y 60 años y C. más de 60.

RESULTADOS
Al valorar la relación AN/AC de las células obtenidas por CE separadas por grupos, no se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos estudiados (p<0.05) (Gráfico I).

Gráfico I:
Relación AN/AC de las células obtenidas por CE. No se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos estudiados (p<0.05)

Al comparar las células de cada uno de los tres grupos teniendo en cuenta el género de los pacientes (Tabla 1), se observó que en las mujeres las células del grupo control y las de los grupos de lesiones se diferenciaron significativamente (p<0.001); en cambio, no se pudo discriminar entre células obtenidas de lesiones precancerosas y cáncer.

Al considerar el género masculino, se observaron diferencias significativas (p<0.05) entre los tres grupos celulares.

Tabla Nº 1
Diferencias entre AN y AC considerando género femenino y masculino por separado.

En los diferentes grupos etarios se encontraron los siguientes resultados:

  • Grupo etario A: las diferencias fueron significativas (p<0.05) entre el grupo control 3 y los grupos 1 y 2.

  • Grupo etario B: no se encontraron diferencias significativas entre los grupos.

  • Grupo etario C: hay diferencias significativas entre el grupo cáncer 1 y los grupos 2 y 3.
DISCUSION

El diagnóstico precoz es una condición importante para el tratamiento efectivo de cualquier enfermedad, pero en particular lo es en oncología, donde la curación de un tumor maligno en estado avanzado es una excepción 11. En este sentido, los profesionales odontólogos tienen un papel fundamental en el diagnóstico y en la detección temprana del cáncer bucal lo que podría llevarse a cabo mediante una rutina exhaustiva en los procedimientos de examen clínico 12.

Los estudios citomorfométricos y los análisis de imágenes de células exfoliadas han sido sugeridos como enfoques claves para definir e identificar cambios celulares y nucleares en los extendidos de dichas células. Hasta hace un tiempo, la citomorfometría se realizaba utilizando métodos planimétricos que luego fueron reemplazados por técnicas de análisis de imágenes que son más rápidas, más precisas y más reproducibles 13. Autores como Odgen (1997) sugirieron que estos análisis asistidos por computadoras podrían incrementar la sensibilidad de la citología exfoliativa.

Por otra parte Cowpe (1985-1988) demostraron que la citología exfoliativa permitía detectar cambios malignos a través de la estimación de la relación del diámetro del núcleo y del citoplasma, concluyendo que los tejidos sometidos a transformaciones malignas típicamente demostraban una reducción del área citoplasmática. 9,14

En nuestro trabajo se realizó citomorfometría de las células superficiales de la mucosa bucal valorando la relación AN/AC, y se compararon las células superficiales de mucosa bucal sana con las de lesiones cancerosas y precancerosas. Si bien es importante tomar células de todos los estratos epiteliales para la evaluación histomorfológica, ya que muchas lesiones displásicas son identificadas primeramente en las capas basales, esta metodología resulta invasiva y dolorosa y va en contra de una de las ventajas esenciales de la citología exfoliativa 15,16,17. Nosotros estudiamos las células más superficiales obtenidas con Cytobrush con el objetivo de disminuir las molestias al paciente, ya que éste es un instrumento adecuado y no invasivo que permite obtener muestras de buena calidad y además es muy sencillo de utilizar por los operadores, resultando en un método más atractivo para realizar programas de proyección en pacientes de riesgo 3.

Ramaesh et al (1998) aplicaron técnicas citométricas para determinar los diámetros del núcleo y del citoplasma de células de la mucosa bucal normal, de lesiones displásicas y de carcinoma bucal de células escamosas (COCE). Encontraron que el diámetro del citoplasma se reduce a partir de las células de la mucosa normal, hacia las lesiones con mayor grado de displasia, hasta adquirir su menor tamaño en las lesiones de COCE. En relación al diámetro del núcleo, encuentran que éste va aumentando desde las células normales hacia las células de lesiones con mayor grado de displasia adquiriendo su mayor diámetro en las células de las lesiones de carcinoma bucal 18. Parece que la reducción del núcleo y el aumento del citoplasma pueden ser indicadores precoces del cambio maligno 19.

Nuestros resultados no mostraron diferencias significativas en lo que se refiere a la relación del tamaño núcleo - citoplasma, cuando se compararon todas las células superficiales de los tres grupos de estudio.

Por otra parte, los estudios de Cowpe (1985 y 1988) concluyeron que 50 células por paciente de un extendido citológico, serían suficientes para indicar cambios malignos y sugirieron que las muestras de mucosa sana del mismo paciente proveían el mejor control 9,14. En nuestro trabajo se midieron 30 células por paciente ya que no todos los extendidos presentaron un número mayor de células posibles de ser medidas.

Cuando se tiene en cuenta el género de los casos, existen pocos trabajos que se basen en este criterio 20,21,22,23. En estudios realizados con citologías exfoliativas tomadas de mucosa gingival se determinaron diferencias significativas entre varones y mujeres de diferentes edades 24. En nuestras observaciones, consideramos cada género por separado encontrando diferencias significativas entre los mismos. En las citologías de los varones los valores citomorfométricos permitieron la discriminación de los tres grupos de estudio. Mientras que en las células de mujeres se diferenciaron significativamente las del grupo control en relación a las de los grupos de lesiones; pero dentro de estos últimos no se pudo discriminar entre células obtenidas de lesiones precancerosas y cáncer.

En la bibliografía se informa que más del 90% de los pacientes con cáncer bucal son mayores de 45 años, siendo la edad media de presentación alrededor de los 60 años 25. Entre el 1 y el 3% de todos los COCE, aparecen en pacientes menores de 40 años 26,27. La presentación del COCE en pacientes jóvenes es rara, aunque esta incidencia parece estar aumentando 28. Para algunos autores, los pacientes jóvenes presentan tumores más agresivos con tasas de recidivas, metástasis cervicales y mortalidad más elevadas 29. Sin embargo, otros estudios no corroboran estos hallazgos 30.

Nosotros encontramos diferencias significativas al considerar las edades de los pacientes. En los más jóvenes (menores de 45 años) se diferenciaron las citologías normales de las tomadas de lesiones, mientras que en los pacientes mayores (con edades de más de 65 años) las diferencias se encontraron entre las lesiones de cáncer y los demás grupos. Pero estos resultados no nos permitieron establecer parámetros característicos de categorías de riesgo que podrían incorporarse a programas de proyección. Una zona claramente demarcada de transformación como ocurre en la mucosa uterina donde las células malignas alcanzan la superficie epitelial en estadios tempranos del tumor, no existe en el cáncer bucal 31. En éste las células malignas pueden ser obtenidas solamente si el carcinoma está muy avanzado o ulcerado 5.

La diferenciación entre los tres grupos de células, sanas, potencialmente malignas y malignas, basada en valores de AC y AN AN/AC tomando solamente las células más superficiales no fue posible en este trabajo. Una de las limitaciones de este estudio fue el número de células obtenidas posibles de ser medidas 30, lo cual se podrá deber a que los operadores que extrajeron las muestras no estuvieron adecuadamente calibrados.

Por lo tanto, deberían realizarse nuevos estudios con más número de células e incorporando análisis moleculares del ADN de las citologías y teniendo en cuenta los hábitos, especialmente de fumar, de los pacientes; esto ayudaría a mejorar la precisión de diagnóstico en los estadios iniciales.

De este modo la citología exfoliativa podría utilizarse como una herramienta valiosa para aplicar en técnicas de proyección, ya que es importante que estas metodologías sean sencillas, poco cruentas y fiables, permitiendo realizar un diagnóstico y seguimiento satisfactorios en los pacientes con lesiones precancerosas y cancerosas bucales.


REFERENCIASBIBLIOGRÁFICAS

  1. Acha A, Ruesga M, Rodríguez M, Martínez De Pancorbo M, Aguirre J. Applications of the bucal scraped (exfoliative) cytology in bucal cancer and precancer. Med Bucal Patol Bucal Cir Bucal (2005); 10:95-102.

  2. Shah J and W Lydiatt. Buccal mucosa, alveolus, retromolar trigone, floor of the mouth, hard palate, and tongue tumors, in Comprehensive Management of Head and Neck Tumors, S. Thawley et al., Ed., pp. 686-694, WB Saunders Co, Philadelphia, Pa, USA, (1999).

  3. Mehrotra R, Gupta A, Singh Mand Ibrahim R. Application of cytology and molecular biology in diagnosing premalignant or malignant bucal lesions. Molecular Cancer (2006) 5:11.

  4. Hullmann M, Reichert TE, Dahse R, von Eggeling F, Pistner H, Kosmehl H, et al. Bucal cytology: historical development, current status, and perspectives. Mund Kiefer Gesichtschir. 2007 Jan; 11(1):1-9.

  5. Mehrotra R, Hullmann M, Smeets R, Reichert T, Driemel O.Bucal cytology revisited. J Bucal Pathol Med (2009) 38: 161-166.

  6. Böcking A, Sproll C, Stöcklein N, Naujoks C, Depprich R, Kübler N, Handschel. Role of Brush Biopsy and DNA Cytometry for Prevention, Diagnosis, Therapy, and Followup Care of Bucal Cancer .Journal of Oncology (2010) 1-5.

  7. Brunotto M, Zárate AM, Cismondi A, Fernández MC, Noher De Halac RI. Valuation of exfoliative cytology as prediction factor in bucal mucosa lesions. Med Bucal Patol Bucal Cir Bucal (2005); 10: Suppl 2:E92-102.

  8. Ogden Gr, Cowpe J, Wight A. Bucal exfoliative cytology: review of methods of assessment. J Bucal Pathol Med (1997); 26:201- 5.

  9. Cowpe J, Longmore R, Green M. Quantitative exfoliative cytology of normal bucal squames: An age, site and sex related survey. J R Soc Med (1985); 78:995-1004.

  10. Diniz Freitas M, García-García A, Martins Carneiro J, Crespo-Abeleira A, Gándara-Rey J. Exfoliative cytology of the bucal mucosa: a cytomorphometric comparison of healthy bucal mucosa in bucal cancer patients and healthy subjects. Rev.Brasileira de Patología Bucal (2003). Versión on-line www.patología bucal.com.bra. ISBN 1677-9630.

  11. Garcia Roco Perez O, Arredondo Lopez M, Alvarez Navarro M. Citología exfoliativa en el diagnóstico precoz de lesiones oncológicas bucales Rev Cubana Estomatol (2002); 39(2).

  12. Vinodh Bhoopathi, Ana Karina Mascarenhas. Effectiveness of Bucal Surgeons Compared with BucalCDx Brush Biopsy in Diagnosing Bucal Dysplastic Lesions. J Bucal Maxillofac Surg (2011) 69:428-431.

  13. Patel P, Kumar S, Kumar V, Vidya Gd. Quantitative cytomorphometric analysis of exfoliated normal gingival cells. J Cytol. (2011) 28(2): 66-72.

  14. Cowpe J, Longmore R, Green M. Quantitative exfoliative cytology of abnormal bucal mucosal smears. J R Soc Med. (1988) 81:509-13.

  15. Walling D, Flaitz C, Adler-Storthz K, Nichols . A non-invasive technique for studying bucal epithelial Epstein-Barr virus infection and disease. Bucal Oncol (2003) 39:436-44.

  16. Sandler HC. The cytological diagnosis of tumors of the bucal cavity. Acta Cytol (1964) 8: 114-20.

  17. Dumbach J, Sitzmann F, Pesch H. DiagnostischesVorgehen bei Verdacht auf Malignom der Mundho¨ hleunter besonderer Beru¨ cksichtigung der Exfoliativ-Zytologie. Dtsch Zahnarztl Z. (1981) 36: 697-700.

  18. Ramaesh T, Mendis BR, Ratnatunga N, Thattil RO. Cytomorphometric análisis of squames obtained from normal bucal mucosa and lesions of bucal leukoplakia and squamous cell carcinoma. J.Bucal Pathol.Med. (1998); 27(2):83-6.

  19. Diniz MD, García AG, Abelleira AC, Carneiro JLM, Gándara JMG. Aplicaciones de la citología exfoliativa en el diagnóstico del cáncer bucal. Med.Bucal Patol.Bucal Cir.Bucal (2004); 9(4):355-61.

  20. Bagán JV, Scully C. Recent advances in Bucal Oncology 2007: Epidemiology, etiopathogenesis, diagnosis and prognostication. Bucal Oncol. (2008); 44(2):103-8.

  21. Gorsky M, Epstein JB, Oakley C, Le ND, Hay J, Stevenson-Moore P. Carcinoma of the tongue: a case series analysis of clinical presentation, risk factors, staging, and outcome. Bucal Surg.Bucal Med.Bucal Pathol.Bucal Radiol.Endod. (2004); 98(5):546-52.

  22. Cheng A, Cox D, Schmidt BL. Bucal squamous cell carcinoma margin discrepancy after resection and pathologic processing. J.Bucal Maxillofac.Surg. (2008); 66(3):523- 9.

  23. Silverman S Jr, Gorsky M. Epidemiologic and demographic update in bucal cancer: California and national data--1973 to 1985. J.Am.Dent.Assoc. (1990); 120(5):495-9.

  24. Punit Vaibhav Patel, Sheela Kumar, Veerendra Kumar, And Gd Vidya Quantitative cytomorphometric analysis of exfoliated normal gingival cells J Cytol. (2011) 28(2): 66-72.

  25. Silverman S,Jr. Demographics and occurrence of bucal and pharyngeal cancers. The outcomes, the trends, the challenge. J.Am.Dent.Assoc. (2001) Nov; 132 Suppl: 7S-11S.

  26. Burzynski NJ, Flynn MB, Faller NM, Ragsdale TL. Squamous cell carcinoma of the upper aerodigestive tract in patients 40 years of age and younger. Bucal Surg.Bucal Med.Bucal Pathol. (1992) Sep; 74(3):404-8.

  27. Hindle I, Nally F. Bucal cancer: a comparative study between 1962-67 and 1980-84 in England and Wales. Br.Dent.J. (1991) Jan; 170(1):15-20.

  28. Mackenzie J, Ah-See K, Thakker N, Sloan P, Maran AG, Birch J, et al. Increasing incidence of bucal cancer amongst young persons: what is the aetiology? Bucal Oncol. (2000) Jul; 36(4):387-9.

  29. Sarkaria JN, Harari PM. Bucal tongue cancer in young adults less than 40 years of age: rationale for aggressive therapy. Head Neck (1994) Mar-Apr; 16(2):107-11.

  30. McGregor AD, Rennie JS. Intra-bucal squamous cell carcinoma in patients under 40 years of age. A report of 13 cases and review of the literature. Br.J.Plast.Surg. (1987) May; 40(3):270-3.

  31. Ogden Gr, Cowpe Jg, Green M. Cytobrush and wooden spatula for bucal exfoliative cytology. A comparison. Acta Cytol (1992) 36: 706-10.